(中山毒理课件)致突变试验方法(预防)

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(中山毒理课件)致突变试验方法(预防)

TJMC 6
DNA原始损伤
• • • • • • • 彗星试验 SCE（姐妹染色单体交换试验） UDS（程序外DNA修复试验）枯草杆菌DNA修复试验 SOS显色试验原噬菌体诱导试验酿酒酵母有丝分裂重组试验
TJMC 7
DNA碱基序列改变（基因突变）
• Ames试验 • Tk基因座或hgprt座突变试验 • 转基因动物试验
• 在DNA合成期，所有染色体均进行复制，复制后形成两条姐妹染色单体。 • 姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange,SCE)指染色体复制过程中同一条染色体中的两条染色单体间发生遗传物质的互换。可能与DNA的断裂和重接有关，故可间接反映DNA损伤。
TJMC 31
• 原理：对于分裂的细胞，如将5－溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）加入合成的原料中，经过2个分裂周期，两条染色单体的其中一条的双股DNA链中的胸腺嘧啶核苷均被BrdU 取代，另一条只有一股被取代。此时，用染色剂如吉姆萨和光处理，使双股含BrdU 的染色单体着色浅淡，而单股含BrdU的染色单体着色深浓。在光镜下，可清晰分辨出发生交换的染色单体。
TJMC 3
生物测试系统
• • • •
微生物细菌、真菌、酵母菌等昆虫果蝇、蟾蜍等哺乳动物细胞株（ CHO、V79 、人类淋巴细胞等）整体哺乳动物（小鼠，大鼠等）植物细胞（紫露草，蚕豆根尖）
TJMC 4
一、致突变试验的基本问题
致突变试验的遗传学终点： DNA原始损伤 DNA碱基序列改变（基因突变）
平板掺入法：用作定量测定
表层培养基＋指示菌±S9＋受试物
阳性培养48小时阴性
TJMC 14
(一)Ames试验

卫生毒理学第八章化学致癌作用及其评价II课件

失活有不同程度关联。
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➢ 肿瘤发生是一个多阶段的过程，通常涉及到多个基因。 ➢ 既有肿瘤抑制基因的失活，也有癌基因的活化，而且
活化或失活的基因不只是一种。 ➢ 癌基因异常可增强细胞的生长和增殖，
抑癌基因异常可消除细胞正常的生长抑制与分化。
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癌基因
癌基因（oncogene）是指其编码的产物与细胞的恶性转化有关的基因。
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第四节化学致癌作用的影响因素
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PAHs分布极为广泛，空气、土壤、水、植物以及食物中都发现了PAHs的存在。有许多苯并（a）芘污染源，如工业废气，香烟烟雾，厨房油烟，烧烤和熏制食品等。人群和动物研究均证实PAHs是人类肺癌及胃癌等重要病因之一。然而并不是所有人接触PAHs都会产生不良的健康效应,即使暴露的环境相同，年龄相近，有些人患了肿瘤，而有些人却安然无恙。
✓ microRNA突变或异位表达与多种人类肿瘤相关。 ✓ microRNA可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。
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Nature 杂志评论称：由麻省理工学院和哈佛大学等单位开展的这些研究“改变了癌症遗传学的前景，开启了理解和诊断癌症的新篇章，将引来肿瘤诊断的潜在革命”， “是肿瘤遗传学的新的里程碑”。
①基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验 );
②染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验;
③原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导 (细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；
④体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c 3T3细胞。
（二）哺乳动物短期致癌试验：

毒理学第七章-致突变

三体记为 2n+1 单体记为 2n-1
单体型——45,x 41
减数分裂中染色体不分离
a 同源染色体不分离；b 姐妹染色单体不分离
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21三体导致先天愚型(Down氏综合征) Down综合征与母亲年龄 43
2．多倍体 (euploid)
正常是2n 染色体数目以染色体组为单位成倍增加，如形成三倍体(triploid)： 3n为69条染色体四倍体(tetroploid)等： 4n为92条染色体。
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2. 平面大分子嵌入DNA链
以非共价结合（静电吸附）形式嵌入DNA 的碱基之间，造成碱基对的缺失或者额外碱基对的增加，引起移码突变
a：臂内倒位
b：臂间倒位
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染色体倒位可能会导致自然流产、不孕不育、畸胎等不良妊娠结局
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4) 易位(translocation)
一个染色体片段的位置改变了染色体发生断裂，断裂片段接到非同源染色体上
相互易位
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慢性粒细胞白血病, 人第22号染色体和第 14号染色体易位
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缺失重复倒位易位
鸟嘌呤（G）6位氧(O6)上的烷化，不与胞嘧啶（C）配对，而是与胸腺嘧啶（T）配对。烷化剂引起的DNA碱基对的改变G:C-A:T
鸟嘌呤脱落，留下无嘌呤或无嘧啶（AP）位点，其他碱基配上，引起突变
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碱基脱落
鸟嘌呤甲基化后脱落，留下AP位点
鸟嘌呤N7位烷化作用的后果有（） A鸟嘌呤脱落 B脱嘌呤 C作用碱基缺失 D移码突变 E以上都是
错义突变：突变后引起氨基酸序列改变无义突变：突变成终止密码子，使肽链合
成提前终止（UAG，UAA，UGA）同义突变：突变后不引起氨基酸序列改变

毒理学食物中化学物质的致突变作用及评价ppt课件

1、生殖细胞突变
致死性突变显性致死：使卵子不能受精或突变配子与正
常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应。
1、生殖细胞突变
非致死突变 ①产生遗传病。 ②对基因库的遗传负荷产生不良影响。基因库是指某一物种的生育年龄群体于特
定时期能将遗传信息传至下一代的基因的总和。遗传负荷指基因库中携带的一定量的有害基因。
间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用。 ③化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。
入选原则： ①选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。 ②实验指示生物应包括若干进化阶段的物种，既要包
括原核生物，又要包括真核生物。 ③体内试验与体外试验配合。 ④应包括生殖细胞和体细胞。通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。
2. 体外试验的活化系统
前致突变物：本身不具致突变性，经哺乳动物代谢才转化成致突变物的化学物质。
①哺乳动物细胞介导：使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。
②S9：经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。
③纯化酶和基因工程。纯化酶：纯化的细胞色素P450、谷光苷肽转移酶、过氧化
二、染色体畸变
二、染色体畸变
指染色体的结构发生改变。染色体型畸变：指两条染色单体都受损。染色单体型畸变：指组成染色体的两条染
色单体中仅一条受损。产生何种畸变，取决于损伤发生在DNA复制前还是复制后。

致突变作用

v 受试物如不溶于水，可用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇作溶剂，DMSO用量每皿不超过0.5ml，乙醇不超过0.1ml。
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v 对照组
v 用溶媒作阴性对照，已知致突变原作阳性对照。 v 对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行设
加S9与不加S9的对照，以证实其为间接诱变物。
z 本身不引起突变，必须在体内经过代谢活化后才具有致突变作用的外源化合物，则称为间接致突变物(indirect mutagen)。
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突变的不良后果
突变的不良后果
体细胞突变
生殖细胞突变
癌致变畸
配
自先
衰
子死发天
老
死胎流畸
亡
产形
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药物致突变作用的检测方法
z 用短期致突变试验来预测化学物质潜在致癌性的设想，自70年代以来逐步得到证实，并为世界所公认。据不完全统计，70年代发展和建立起来的短期致突变方法多达100多种，但均各有优缺点，需要不同检测方法的互相补充和引证。
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z 优点： 1.可用来作为诱变指示物的微生物有噬菌体、
细菌和真菌等。 2.微生物具有繁殖快、个体数量多、容易观察
检出等特点，而且方法较为敏感、检出率较高、试验周期短、费用也较低。
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缺点：
1.微生物是单细胞生物，与哺乳动物及人类有较大的差别，例如核结构不同、DNA裸露而且数量少、分子小、对化学诱变原不能进行代谢活化或降解以及缺乏免疫系统等。
v 同法滴加四环素溶液，可鉴定PAQ1质粒。
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⑤ 自发回变数测定：受试菌株在保存或培养过程中，能产生自发回变。
v 不同菌株的自发回变数有一定范围， T A97( 9 0 ~ 1 8 0 ) 、 T A98( 1 5 ~ 6 0 ) 、 TA100(75~200)、TA102 (240~360)。

关于化学毒物致突变作用课件

减数分裂(meiosis)指通过两个细胞周期使染色体数目减少一半的细胞分裂方式。它是一种特殊的有丝分裂。其细胞核分裂两次，而染色体只复制一次，经过分裂后染色体数目减少一半，变成单倍体(haploid)。
第二节化学毒物致突变的类型
有三类遗传学损伤，即基因突变、染色体畸变及染色体数目改变。这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损。通常以光学显微镜的分辨率0.2 µm，来区分基因突变和染色体畸变。因突变是用光学显微镜观察不到，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变和数目变化可用光学显微镜进行观察。
即染色体畸变(chromosome aberration)。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。能够引起突变的物质称为致突变物 (mutagen)。二、遗传学基础 1.DNA与基因
在真核细胞中，遗传信息储存在核内的DNA链上，DNA是大分子物质，由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，其基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构。基因
生殖细胞(germ cell)往往是单倍体，其染色体改变即突变可传给下一代。突变的生殖细胞根据其在二倍体中的表达，分为显性或隐性。显性突变无论纯合子，还是杂合子均会出现表型异常；隐性突变如为纯合子，将出现表型异常，若为杂合子，则为表型正常的携带者。
4.基因型与表型基因型系指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗传组
在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体(chromosome)，故染色质与染色体是由相同物质组成的；染色体存在于细胞中，通常只有在细胞分裂时经过特殊染色才能清楚地看到。
染色体与基因有着平行的关系，表现为：①染色体可以在显微镜下看到，有一定的形态结构。基因是遗传学的单位，每对基因在杂交中仍保持它们的完整性和独立性。

毒理07化学毒物致突变作用

鼠伤寒沙门菌野生型（原养型）←→组氨酸营养缺陷型突变株（his+）回复突变（his）
如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。
Ames试验中使用的标准菌株为TA97、TA98、TA 100和TA 102。his-突变外，附加突变：①深粗糙型突变（rfa）、②切除修复基因uvrB缺失（△uvrB）和③抗药因子（R因子即抗氨苄青霉素的PKMl01质粒和抗四环素的PAQ1质粒）。
A.遗传负荷增加
B.衰老
C.肿瘤
D.动脉粥样硬化
E.癌症
[答疑编号111070103：针对该题提问]
『正确答案』A
4.微核试验可用于检测（）
A.DNA加合物
B.引起核碎的遗传毒物
C.断裂剂
D.引起碱基置换的遗传毒物
A1 型题
1.易位是（）
A.当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180°再重接
B.从某个染色体断下的节段接到另一染色体上
C.在同一染色体内染色单体交换
D.在不同染色体间染色单体交换
E.染色体发生一次或多次断裂而不重接
[答疑编号111070101：针对该题提问]
微核是染色体断片或因纺锤体受损伤而迟滞的整个染色体，分裂的后期仍留在子细胞的胞质内。检测断裂剂和有丝分裂毒物。
常用的是啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞。在主核排出时微核可留在胞浆中。
3.染色体畸变试验
细胞遗传学检验，即制备中期相染色体标本，在光镜下观察染色体形态结构和数目改变。遗传学终点为染色体畸变。
第七单元化学毒物致突变作用
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外源化学物致突变作用PPT课件

第23页/共108页
• ③ 无义突变：碱基取代的结果是使mRNA上的密码子转变成为终止密码UAA、UAG、UGA时，出现翻译过程停止，肽链延长提前结束。 • 链终止突变：指无义突变使肽链过早终止。
第24页/共108页
• ④终止密码突变：碱基取代的结果是使mRNA的终止密码转变成某种氨基酸的密码，则合成的肽链将延长到出现下一个终止密码才结束。 • 延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象。
• 转换(transition)：指原来的嘌呤被另一个嘌呤所取代或原来的嘧啶被另一个嘧啶所取代。
• 颠换(transvertion)：指原来的嘌呤被另一个嘧啶所取代或原来的嘧啶被另一个嘌呤所取代。
第21页/共108页
碱基置换的后果
• ① 同义突变：一个氨基酸可有2－6种密码子，当密码子的一个碱基被另一个碱基所取代时，密码子的意义恰恰没有改变，即同义突变。
• 染色体畸变 (chromosome aberration)：染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。 • 染色体结构改变 • 染色体数目改变
第17页/共108页
一、基因突变
• 基因突变：指基因中DNA序列的变化。因为基因突变限制在一个特定的部位，故称为点突变(point mutation)。
• 突变基因：存在突变的基因野生型基因：没有发生突变的基因
• 基因突变可分为两种类型： • 碱基置换(base substitution) • 移码突变 (frame shift mutation)
第18页/共108页
一、基因突变
• 1.碱基置换(base substitution)
• 某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。 • 当DNA链上某一碱基由于致突变物作用而脱落或其配

《动物毒理学》课件：第六章特殊毒性作用

❖ 1968年，日本上野制药公司合成出AF2 ❖ 高效杀菌的新型硝基类化合物 ❖ 当时称为：划时代食品防腐剂
❖ 通过了大阪大学医学系病理学教研室的急、慢性毒性试验
❖ 厚生省的批准，商品化，广泛应用了几年 ❖ 1973年的9月，第二次日本环境诱变剂会上，认为
AF2有遗传毒性 ❖ 1974年8月证实了具有致癌性，禁止 ❖ 专家：即使禁止使用10年后，日本人的消化器官
基因突变（1）——碱基置换
❖ 碱基替换：指DNA分子中一个碱基被另一个不同的碱基所替换。
转换：嘌呤颠换：嘌呤
嘌呤，嘧啶嘧啶
嘧啶
1) 同义突变
同义突变 (Synonymous mutation)：由于密码子具有兼并性，单个碱基置换后密码子所编码的是同一种氨基酸，表型不改变。
亮氨酸
❖ 正常 AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG … DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro
事件
作者
发现X射线可以改变生殖细胞的 DeVries 遗传物质
用X射线照射果蝇发现可以引起 Muller 基因突变
发现芥子气可诱发基因和染色体 Averbach &
畸变
Robson
用X射线可诱发小鼠突变
化学物可诱发小鼠突变
Russed
成立国际环境诱变剂学会
Guttanach
例：日本新型食品防腐剂AF2
❖ 同义突变 AGT CAG CAG CAG TTT TTG CGT AAC CCG … DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro
2) 错义突变
错义突变 (Missense mutation)：DNA分子中的碱基置换后，形成新的密码子，从而导致所编码的氨基酸发生改变，产生活性降低、无活性或无功能的蛋白质。

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TJMC 11
三、重要的致突变试验
(一)Ames试验 (鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验)
1. 原理：是利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测物质致突变性的方法。常用的组氨酸缺陷型沙门氏菌，均各含有控制组氨酸合成的基因，当培养基中不含有组氨酸时它们不能生长。但在受到某些致突变物作用时，菌体内DNA 特定部位发生基因突变而回复为野生型菌，此时，培养基中不含组氨酸该菌也能够生长。 2. 常用菌株：目前推荐使用
五、突变的后果
TJMC 2
第二节致突变试验方法
一、致突变试验的基本问题
定义：确定化合物是否具有致突变作用的试验。目的：检测化合物是否具有致突变作用用以推测是否具有致癌、致畸等的可能性为化合物的可使用性研究和卫生标准制定提供依据基本原理：将化合物与生物测试系统接触，然后观察该生物系统是否发生致突变性检测指标的改变，以判定其是否具有致突变性。凡能使生物测试系统发生突变的化合物，即可认为具有致突变作用。
第七章外源化学物致突变作用
公共卫生学院卫生毒理学系
toxicology@
TJMC 1
第一节致突变作用
一、基本概念二、致突变的因素三、突变的类型四、致突变作用机制
第二节致突变试验方法
一、致突变试验的基本问题二、致突变试验的分类
三、重要的致突变试验
四、致突变试验方法的选择利用
由于形成的园形或杏形结构较正常核小（小于正常间期核的1/3～1/5，红细胞直径的1/20～1/5），故称为微核。
2. 方法
3. 结果分析每个剂量组至少观察5000个细胞细胞微核率（‰）
TJMC 20
微核嗜Leabharlann 染细胞TJMC 21(四)显性致死突变试验
1. 原理显性致死是指在发育中的生殖细胞（精子）在
染色体完整性改变（染色体畸变）
染色体组畸变（非整倍体）
TJMC 5
• 遗传学终点（genetic endpoint)：指致突变试验的观察终点，因为不少致突变试验的观察终点并不反映基因突变、染色体畸变或染色体组畸变类型，而是反映致突变过程中发生的其他事件。如微核是检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂。
TJMC 6
DNA原始损伤
• • • • • • • 彗星试验 SCE（姐妹染色单体交换试验） UDS（程序外DNA修复试验）枯草杆菌DNA修复试验 SOS显色试验原噬菌体诱导试验酿酒酵母有丝分裂重组试验
TJMC 7
DNA碱基序列改变（基因突变）
• Ames试验 • Tk基因座或hgprt座突变试验 • 转基因动物试验
TJMC 8
染色体完整性改变（染色体畸变）
• 微核试验 • 染色体畸变分析
TJMC 9
染色体组畸变（非整倍体）
• 染色体畸变分析 • 显性致死试验 • 微核试验
TJMC 10
二、致突变试验的分类
根据检出的突变类型分类
根据生物测试系统分类
根据试验时间长短分类根据试验进行的方式分类根据发生突变的细胞分类根据检测终点分类
1. 原理：将受试物与检测系统(动物或细胞)接触，然后直接观察生物体的细胞染色体发生的结构或数目的改变。
可在体细胞(骨髓细胞、外周血细胞)或生殖细胞(精原细胞)进行。可为体外试验，也可为体内试验。 2. 具体方法 3. 结果分析每个剂量组至少观察500个中期分裂相细胞细胞畸变率（％）染色体畸变率（％）
致突变物的作用下发生了染色体损伤，从而使受精卵在发
育过程中死亡。由于发生在子 1 代，故称为显性致死。因此，可以利用这一原理来检测化学物质的致突变性。该试验是间接观察生殖细胞染色体损伤的方法。
TJMC 22
(四)显性致死突变试验 2. 方法选择雄性成年动物(小鼠或大鼠)
并接触受试物(6天或3个月)
TJMC 17
断片
TJMC 18
染色体图像分析系统
染色体被自动排序
TJMC 19
(三)微核试验
1. 原理：细胞染色体在致突变物的作用下出现断裂，部分碎片在有丝分裂末期不参入细胞核，而存留在间期细胞质内，形成一个或几个园形或杏形结构，并保留一段时间。因此，可以通过微核的检测推断受试物的致突变性。
与雌性动物(每周交换一批)同笼交配6～8周同笼第17～19天处死雌鼠并取出子宫进行检查 (受孕情况，活胎数，早期死亡和晚期死亡胚胎数)
TJMC 23
TJMC 24
(四)显性致死突变试验 3. 结果分析最主要的观察指标是早期胚胎死亡数，它可以反映化合物致突变作用的强弱。受孕率(%)＝(受孕鼠/交配雌鼠数)×100 总着床数＝活胎数＋早期胚胎死亡数＋晚期胚胎死亡数
平板掺入法：用作定量测定
表层培养基＋指示菌±S9＋受试物
阳性培养48小时阴性
TJMC 14
(一)Ames试验
3. 化合物的测试及结果评价：
阳性结果判定： ①平均每皿回变菌落数为对照(自发回变菌落数)的2倍及以上 ②可重复性，用一个相应菌株重复 (阴性全套菌株重复)； ③有剂量－反应关系。试验中注意设立阳性和阴性对照组。
TJMC 15
(一)Ames试验 4. 试验的优缺点：
检出率较高、重现性好、简便、快速、经济；
使用S9，具有与体内相似的代谢特点；固体、液体、气体样品均可检测；微生物遗传密码甚少；远不及哺乳动物；受试物需命中限定数目的靶基因，才能显示致突变活性。
TJMC 16
(二)染色体畸变分析
TJMC 3
生物测试系统
• • • •
微生物细菌、真菌、酵母菌等昆虫果蝇、蟾蜍等哺乳动物细胞株（ CHO、V79 、人类淋巴细胞等）整体哺乳动物（小鼠，大鼠等）植物细胞（紫露草，蚕豆根尖）
TJMC 4
一、致突变试验的基本问题
致突变试验的遗传学终点： DNA原始损伤 DNA碱基序列改变（基因突变）
TA100 TA102 TA1535 TA97 TA98
（测试碱基置换）（测试移码突变）
TJMC 12
(一)Ames试验
3. 化合物的测试及结果评价：
点试法：用作定性试验，适用于短期大量筛选
表层培养基＋指示菌±S9 受试物10μl
阳性
培养48小时阴性
TJMC 13
(一)Ames试验
3. 化合物的测试及结果评价：

(中山毒理课件)致突变试验方法(预防)

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