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一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
实验五凝胶层析法脱盐和分离蛋白质实验五凝胶层析法脱盐和分离蛋白质实验类型:验证型目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作。
原理凡盐析所获得的粗制蛋白质(盐析得到的IgG)中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”(desalthing)。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽;凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤(gel filtration)，又称为凝胶层析(gelchromatography)、分子筛过滤(molecular sieve filtration)、凝胶渗透层析(gel osmotic chromatography)等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢;大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱;小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
葡聚糖凝胶层析法 The document was finally revised on 2021实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
(2) 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。
(3) 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—200010毫克，溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。
(4) 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。
(5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)【实验操作】1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀2小时，一般采用后一种方法。
再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。
2.装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。
层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。
将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。
装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。
再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。
平衡后，拧紧下端螺旋夹。
3.加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。
取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。
打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。
当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。
用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。
最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3—4cm。
4.洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。
仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。
将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。
5.凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。
【实验结果】以洗脱管号为横坐标，以光密度为纵坐标作图即得洗脱曲线。
分析曲线图并讨论实验结果。
【思考题】1.葡聚糖凝胶层析为何能分离不同的样品？2.葡聚糖凝胶层析操作时应注意哪些问题？Experiment 5. Sephadex Gel Chromatography【Purpose】1. Study the characterization of Sephadex gel and main principle of gel chromatography2. Master the basic operational techniques of gel chromatography.【Principle】Gel filtration (also called molecular exclusive chromatography or gel sieve) is a kind of chromatography technique based on the difference of molecular weight and is one of the effective and mild methods extensively used to isolate and analyze the biomacromocular substances. The solid phase vector of this chromatography is gel particle, which has the effect of molecular sieve; at present the most widely used gel has various apertures, such as dextran gel (trade name: Sephadex), and agarose gel (tradename: Sepharose).Sephadex gel is a kind of macromolecular compound composed of dextran of some molecular weigh dextrose - glycoside and chloroacetone and it has multiple reticulation structure. The gel of different "mesh" can be acquired by controlling the ratio of chloroacetone and dextran in cross- linking agent, and by controlling the condition of cross - link reaction to control the cross - linked degree. The higher the cross-link degree, the tighter the mesh structure, and vise versa. Mesh size determines the molecular range at which the isolated material could enter into the internal gel freely. By this means, the molecular weigh of the isolated material could range from several hundred to several hundred thousand.Sephadex gel chromatography is based on the principle that when the substances being isolated flow through the chromatography column, each component shifts at different rate because of the different molecular weight and the difference of obstruction in solid phase. The material molecular is larger than what can permissively enter into the gel mesh will be excluded completely; so it can not enter into the interior of gel particle, and the effect of exclusion is low; its course is short and shift rate is rapid, so it first flows out of the chromatography column with the solvent flowing between gel particles. On the contrary, the material of smaller molecular weigh penetrate into gel particle completely, so its effect of exclusion is high, its course is long and shift rate is slow, and as a result it flows out of the column later. If the molecular of the material is between that of completely excluded and that of completely penetrated, the material will flow out of the column between them. So we can isolate materials by this means.In this experiment, we use Sephadex G-25 as phase vector to separate Blue Sephadex-2000 and bromophenol blue. The molecular weight of blue sephadex-2000 is approximately 2×106, while the molecular weight of bromophenol is about 670. Because of the obvious molecular difference, the former can be excluded completely and the latter can enter into the gel particle, so they can be separated by different elution time.【Materials】1. ApparatusChromatography column (1×20cm) with latex tubing and clips, A beaker of 100ml, Test tubes and test tube shelf, Measuring cylinder 10ml, 721 type spectrophotometer2. Reagents(1) Tris-Acetate buffer ( pH7.0)Take 0.01mol/L Tris solution (contains 0.1mol/L KCl) 900ml, adjust pH value to 7.0 by acetate, then add distilled water to 1000ml.(2)Bromophenol solutionWeigh 10mg bromophenol, dissolved in 5ml ethanol, stir to make it effectively solve, then add Tris-acetate buffer(pH7.0) gradually till the solution becomes dark blue.(3)Blue sephadex-2000 solution:Take blue sephadex-2000 10mg, dissolved in 2ml Tris-acetate buffer (pH7.0).(4)Sample: Take the mixture of 0.1ml bromophenol and 0.5ml Blue sephadex-2000(5)Sephadex G-25【Procedures】1. Gel preparationThe gel we buy is dry particles, so before using it, expand it. In this experiment, add 4g Sephadex G-25 to 50ml distilled water, stir, expand 6 hours at room temperature, or 2 hours in boiling, commonly we choose boiling. Remove the upper water and small particles with pour method, wash gel with distilled water several times, then wash it with tris-acetate buffer (pH7.0) several times to make the pH and ion concentration reach balance. Finally remove bubble in the gel and also solution, and then the gel can be preserved in the buffer.2. StuffingFix a clean chromatography column on the iron bracket vertically, choose the membrane end as the bottom part, add latex tube and clip it. Add eluent, open the exit to let the solution flow out, remove the bubbles, and then fix the clip when there is eluent about 2 cm higher than the gel surface. Stir the gel gently, add it with glassy stick along the inner wall of column, open the exit when the height of the gel deposited in the bottom of the column reaches 1cm, continue stuffing till the column bed reaches 10cm, shut off the exit. It should be ensured that there is no bubble or layers of the column bed in the process, or again. After filling, wash the column bed with eluent (about 1 to 2 column volume) and keep steady eluent on the surface of gel. After balancing it, shut off the exit.3. Loading sampleOpen the exit to make the eluent flow out till the bed surface meets the liquid surface, shut off the exit. Load 0.3ml sample, the mixture of bromophenol and blue sephadex-2000, carefully on the gel surface, do not stir the column bed surface. Open the exit to let the sample enter into the gel and begin to collect the eluent. When the sample solution flows to the surface of gel, shut off the exit. Wash the sampling region with little eluent three times and on each time, make sure the washing eluent flow completely into the gel. Finally ass eluent on the gel surface and keep the height of eluent 3-4cm higher than the gel surface.4. Elution and CollectionAdjust the speeding of eluent to about 1ml/min. Observe the seperation process of the sample in the chromatography column, collect the eluent about 3ml per test tube, and number those test tubes. After collecting about 20 test tubes of eluent, the sample can be totally washed out. Inspect the absorbance with 721 type spectrophotometer under the wavelength 540nm of those eluent in each test tube.5. Regeneration gelAfter washing out the sample, wash the gel with the eluent about 3 times of column volume.Put a glass beaker on the exit end, open bottom end and upper end slowly and respectively, then the gel flows into the beaker and can be used again.【Results】The number of test tube is x-axis, and the absorbance is y-axis. Draw the elution curve. Analysis the curve and discuss the experiment result.【Questions】1. What is the principle of separating components in mixture with Sephadex Gel Chromatography?2. What are the attentions in Sephadex Gel Chromatography?。
