破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达杨晓强1 赵亚刚1 孙大勇1 姜泊2 陈学清3（1广州军区广州总医院消化内科5100102南方医科大学附属南方医院消化内科510515，3广州医学院第一附属医院消化内科510120）【摘要】目的：构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体，并验证其生物活性。

方法:采用基因拼接的方法获得破伤风Ｃ片段基因，依次连接至分泌表达的乳链菌表达载体及膜锚定表达的乳链菌表达载体。

电穿孔转化乳链菌，分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白，通过蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况。

结果：分泌表达的TETC大小约为57.8kDa，表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%，锚定表达的TETC大小约为73.5 kDa的表达蛋白，表达量占总体蛋白的10.7%,膜蛋白的17.9%；Western-blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。

结论：成功获得了TETC基因，构建了TETC乳链菌表达载体，并在乳链菌内表达了TETC，并初步验证了表达的TETC的生物活性，为研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定了基础。

【关键词】基因拼接；破伤风毒素C片段；乳链菌；生物佐剂；疫苗中国图书资料分类号Q939.11Expression of tetanus toxin C fragment in Lactococcus lactisYang Xiao-qiang1,Zhao Ya-gang1, Sun Da-yong1,Jiang BO2，Chen Xue-qing31 Department of gastroenterology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command,Guangzhou 510010,China.2 Department of gastroenterology, Nanfang Hospital,Southern medical university, Guangzhou 510515, China.3 Department of gastroenterology,First affiliated hospital, Guangzhou medical college, Guangzhou 510120, China.Abstract Objective To expreess the tetanus toxin C fragment(TETC) and test its bioactivity in lactococcus lactis. Methods, The gene of the tetanus toxin C fragment was designed based on the amino acid code of lactococcus lactis and acquired using the PCR based gene assembly, then cloned into the lactococcus lactis secreted expression system pNBC1000 and cell wall anchored expression system基金项目: 国家自然科学基金自由申请面上项目(30570839), 广东省自然科学基金(05004735)通信作者: 杨晓强. 博士, 主治医师. 电话: （020）36653552 Email:harderware@pNBC2000 to form pNBC1002 and pNBC2002, the confirmed sequence was cut and ligated to pTRKH2 a shuttle vector for E. coli and Lactococcus Lactis to generate pNBCL1002 and pNBCL2002. pNBCL1001 and pNBCL2002 were transformed into Lactococcus Lactis by electroporation. Protein electrophoresis and Western-Blot were used to detect the expession of TETC and its bioactivity. Results Th e TETC expression vectors were constructed successfully. The secretory form of TETC had a weight of57.8kDa and the portion of recombinant protein was over 8.06% of the total cell protein, and over 9.82% of the supernatant protein. The cell anchored form of TETC had a weight of73.5 kDa, with the recombinant protein portion of 10.7% over the total cell protein and 17.9% over the cell wall protein. All the forms of TETC could be deteced with the tetanus antitoxin by western blotting. Conclusion The recombinant lactococcus lactis expressing the TETC may lay a foundation for biology adjuvant and vaccine against tetanus.Key Words：PCR based gene assembly; tetanus toxin C fragment , Lactococcus lactis ,biology adjuvan,vaccine破伤风杆菌为一种G+杆菌，所产生的毒素为致病的主要因素，而破伤风毒素的C片段（TETC 或TTFC）是毒素的重链部分，为神经节苷脂结合区域，是一种无毒的抗破伤风保护性抗原。

奶牛破伤风的病因分析奶牛破伤风的临床症状及防治措施-奶牛养殖破伤风是一种急性、中毒性的人、畜传染病,是通过创伤感染破伤风梭菌而引起,也叫做脐带风、锁口风、强直症等。

病牛的主要特征是机体全身骨骼肌或者部分肌群持续出现强直性痉挛,且受到外界刺激会表现出明显的兴奋,较严重的损害养牛生产的经济效益。

下面就一起来具体了解一下：奶牛破伤风的病因分析奶牛破伤风的临床症状及防治措施。

1、病因分析破伤风梭状芽胞杆菌是引起该病的病原，简称为破伤风梭菌，通过创口发生感染，并生成毒素，对机体的运动中枢神经系统造成损害，从而出现发病。

破伤风梭菌是一种革兰氏阳性菌，没有荚膜，生有鞭毛，能够自行运动，往往在厌氧条件下能够良好生长。

在自然界中广泛存在该菌，如土壤、粪便以及尘土中等，非常容易通过创口感染而导致易感牛发生该病。

奶牛破伤风通常在各地都存在散发，任何家畜都能够感染，其中奶牛具有较大的易感性。

该病主要通过创口感染，尤其是深且狭小的创伤（如刺伤、钉伤等），并被坏死组织、粪便或者泥土封闭而形成厌氧环境，非常容易发生该病。

另外，外科手术、预防注射没有严格消毒、使役不当，母牛分娩过程只能够损伤产道、产后感染，犊牛去势、断脐过短，都会形成创伤，如果没有及时采取有效处理往往就会引起发病。

部分病牛通常无法确定感染途径，这是由于在侵入芽孢后而表现出症状前，创伤已经愈合，需要在一定时间之后侵入组织内的芽孢才能够在厌氧条件下大量生长繁殖，生成大量毒素，从而引起发病。

2、临床症状该病具有1-2星期左右的潜伏期。

发病初期，病牛头部肌肉出现强直性痉挛，采食、咀嚼以及吞咽动作异常，速度缓慢，随着病程的进展，会导致全身出现明显的强直症，呈现口闭锁，大量流涎，呈线状。

颈背硬直，显露静脉沟，瞬膜突出，耳竖立不动，腹部缩起，尾劲直，略微朝一侧偏斜。

脊柱往往呈直线状，有时出现角弓反张。

四肢硬直，关节较难屈曲，蹄部无法提起，拒绝走动，很难转弯或者后退，只要倒地基本无法自行起立。

高三生物晚练周四4月6日1．破伤风杆菌一般在较深伤口内繁殖，可产生外毒素使机体发病，的是而外毒素的毒性可被胰蛋白酶解除。

下列有关分析错误．．A．破伤风杆菌的呼吸方式为无氧呼吸B．破伤风杆菌分泌的外毒素是在内质网上的核糖体合成的C．破伤风杆菌分泌的外毒素不能直接作为疫苗进行预防接种D．破伤风杆菌生命活动所需的能量来源于有机物的氧化分解2．甲、乙分别为物质进出细胞的坐标图和模式图，下列相关说法正确的是A．甲、乙所代表的物质运输方式没有共同点B．图乙的物质运输过程与细胞膜的流动性无关C．图乙所示的细胞可能是红细胞D．婴幼儿肠道吸收乳汁中的免疫球蛋白可用图乙中的跨膜运输方式表示3。

下列对下图曲线a和b“可分别代表”的描述，错误的是（)．．A。

细胞分裂间期DNA含量和ATP量B.细胞分化程度与全能性表现能力的变化C。

质壁分离过程中细胞渗透吸水能力和原生质体体积的变化D。

萌发的植物种子在出土之前有机物种类和干重的变化4．下图为某湖泊生态系统的生物关系（a～d示能量数值），下列各项叙述正．确．的是A．该图可以表示某湖泊生态系统的能量流动过程图B．流经该湖泊生态系统的总能量为a+b+c+dC．图中d包含第二营养级所排粪便中的能量D．生产者流向初级消费者的能量传递效率为b/a×100%5．如图为去掉某棉花植株顶芽前后，其侧芽部位生长素和细胞分裂素的浓度变化及侧芽长度变化曲线。

下列有关叙述正确的是A．激素甲为细胞分裂素，激素乙为生长素B．两种激素在高浓度时对侧芽的萌动均起促进作用C．图示过程能体现生长素作用的两重性D．图示过程说明生长素对侧芽的萌动起抑制作用6．下列实验材料的选择与该实验的目的相符合的是实验名称实验材料①观察DNA和RNA在细人的口腔上皮②探究温度对酶活性的影过氧化氢酶③观察细胞的质壁分离与洋葱根尖分生④观察细胞中线粒体的分菠菜的叶肉细A．①③④B．①②③C．①D．①②③④7、如图l为a、b、c三种植物的光强-光合曲线，图2表示在适宜的光照、CO2浓度等条件下测得的温度一光合、呼吸曲线．请分析并回答下列问题：（1）由图l可知:在连续阴雨的环境中，生长受影响最小的植物是_ _____．当光强为1500kLx时，对CO2利用率最高的植物是______．（2）图2中的虚线表示______．当温度达到______时,植物不再进行光合作用．（3）图2中，40℃与60℃时，CO2的吸收量均为0，二者的区别是___ __ _．(4）在温度为30℃时，叶肉细胞内的［H］用于______．8、某种自花受粉、闭花传粉的植物,其花的颜色为白色，茎有粗、中粗和细三种。

厌氧性细菌第13章厌氧性细菌（anaerobic bacteria）⼀、概述1. ⽣长、代谢不需要氧⽓，主要分布在⼟壤、⼈和动物肠道，利⽤发酵获取能量。

2. 根据能否形成芽胞：厌氧芽胞梭菌属和⽆芽胞厌氧菌3. 严格厌氧菌，⾰兰阳性(G+)4. 芽胞⽐菌体粗，菌体膨⼤呈梭状，抵抗⼒强（耐热、⼲燥、消毒剂）5. ⼀般有周鞭⽑，⽆荚膜（除产⽓荚膜梭菌外）6. 致病菌（破伤风梭菌、产⽓荚膜梭菌、⾁毒梭菌）繁殖体产⽣外毒素，病情严重7. 防治：类毒素与抗毒素⼆、破伤风梭菌（C．tetani）（⼀）⽣物学性状1. G+，菌体细长，周鞭⽑，芽胞正圆，位于菌体顶端，使细菌呈⿎槌状（典型特征）2. ⾎平板上薄膜状迁徙⽣长，伴β溶⾎，庖⾁培养基⼤多⽣化反应阴性，不发酵糖类，不分解蛋⽩质3. 抵抗⼒：芽胞抵抗⼒很强75~80℃10min仍保持活⼒，100℃1⼩时⽅被破坏，在⼲燥的⼟壤和尘埃中可存活数年。

（⼆）致病性与免疫性1. 致病条件①伤⼝需形成厌氧微环境（重要条件）②伤⼝窄⽽深（刺伤），有泥⼟或异物污染③⼤⾯积创伤、烧伤，坏死组织多，局部组织缺⾎④有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤⼝（⽆侵袭⼒，仅在局部繁殖，其致病作⽤完全有赖于病菌所产⽣的外毒素）2.致病因⼦（1）对氧敏感的破伤风溶⾎毒素(tetanolysin)（2）质粒编码的破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)——主要致病物质1）属神经毒(neurotoxin)，蛋⽩质，可被蛋⽩酶破坏，不耐热, 60℃30mins毒性极强:⼩⿏LD50为0.015 ng，对⼈致死量<1µg靶细胞为脊髓前⾓细胞和脑⼲神经细胞2）破伤风痉挛毒素结构在菌体内合成⼀条多肽，释出菌体时，被细菌蛋⽩裂解酶裂解成轻链（A链）-S-S-重链（B链）A链：毒性作⽤；B链：神经节苷脂结合单位3）破伤风痉挛毒素作⽤机制：①与神经系统的结合B链C端识别神经肌⾁结合点运动神经元外胞浆膜上的受体并结合，促使毒素进⼊细胞内的⼩泡中。

实验四厌氧菌一、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌（一）目的要求1. 掌握破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌的形态特点、培养特性和鉴别要点。

2. 熟悉破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的分离培养过程、鉴别的一般原则和常用方法。

3. 解破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的外毒素毒性动物实验。

（二）器材和试剂1．菌种破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌菌种及其形态示教片。

2．培养基疱肉培养基、血琼脂培养基、牛乳培养基、五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵管、牛心脑浸液肉汤与琼脂、脂酶培养基。

卵黄琼脂、溴甲酚紫牛乳培养基。

3. 试剂革兰染色液（一套）、芽胞染色液（石炭酸复红、95％酒精、碱性美蓝）、焦性没食子酸、100g/L氢氧化钾、溴甲酚紫；产气荚膜梭菌抗血清、肉毒梭菌多价抗血清、索氏梭菌抗血清；2０g／L尿素L-色氨酸、硝酸盐还原试剂、欧氏试剂、美蓝指示剂。

4. 其他小白鼠、家兔、无菌注射器、无菌吸管、滴管、中、小试管、消毒纱布块；固体石蜡或凡士林、酒精灯、三角架、碘酒、酒精、生理盐水、蒸馏水；剪刀、镊子、玻片、药勺、钯粒；厌氧袋、厌氧罐、离心机、水浴锅等。

（三）步骤和方法1．破伤风棱菌（1）形态观察观察破伤风梭菌示教片，其繁殖体型为革兰阳性细长杆菌，散在排列，芽胞型的芽胞呈正圆形，位于菌体顶端，直径大于菌体，使芽胞和菌体呈鼓槌状；该菌鞭毛为周身鞭毛。

（2）培养物观察破伤风梭菌在疱肉培养基中生长缓慢，厌氧培养2～7天后其生长现象为培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑，有少量气体。

生成的甲基硫醇、H２S等使培养物变臭。

破伤风梭菌在血琼脂平板上形成圆形、扁平的菌落。

菌落中心结实，周边疏松似“羽毛状”。

菌落周围有α溶血环，培养时间延长可变为β溶血环。

（3）生化反应将五糖发酵管与牛乳培养基置水浴锅中加热。

热煮沸10min，迅速冷却。

以无菌吸管吸取破伤风梭菌纯培养物，分别滴加。

于牛乳培养基与五糖发酵管中，接种毕，在液面上加一薄层熔化的石蜡。

医学微生物答案第1、2章细菌的形态结构与生理测试题答案一、名词解释答案1.微生物：存在于自然界形体微小，数量繁多，肉眼看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜放大数百倍甚至上万倍，才能观察的一群微小低等生物体。

2.微生物学：用以研究微生物的分布、形态结构、生命活动（包括生理代谢、生长繁殖）、遗传与变异、在自然界的分布与环境相互作用以及控制它们的一门科学。

3.医学微生物学：主要研究与人类医学有关的病原微生物的生物学性状、对人体感染和致病的机理、特异性诊断方法以及预防和治疗感染性疾病的措施，以控制甚至消灭此类疾病为目的的一门科学。

4.代时：细菌分裂倍增的必须时间。

5.细胞壁：是包被于细菌细胞膜外的坚韧而富有弹性的膜状结构。

6.肽聚糖或粘肽：是原核细胞型微生物细胞壁的特有成分，主要由聚糖骨架、四肽侧链及肽链或肽键间交联桥构成。

7.脂多糖：革兰阴性菌细胞壁外膜伸出的特殊结构，即细菌内毒素。

由类脂A、核心多糖和特异多糖构成。

8.质粒:是细菌染色体外的遗传物质，结构为双链闭合环状DNA，带有遗传信息，具有自我复制功能。

可使细菌获得某些特定性状，如耐药、毒力等。

9.荚膜：某些细菌能分泌黏液状物质包围于细胞壁外，形成一层和菌体界限分明、不易着色的透明圈。

主要由多糖组成，少数细菌为多肽。

其主要的功能是抗吞噬作用，并具有抗原性。

10.鞭毛：是从细菌细胞膜伸出于菌体外的细长弯曲的蛋白丝状物，是细菌的运动器官，见于革兰阴性菌、弧菌和螺菌。

11.菌毛：是存在于细菌表面，有蛋白质组成的纤细，短而直的毛状结构，只有用电子显微镜才能观察，多见于革兰阴性菌。

12.芽胞：某些细菌在一定条件下，在菌体内形成一个圆形或卵圆形的小体。

见于革兰阳性菌，如需氧芽胞菌和厌氧芽胞杆菌。

是细菌在不利环境下的休眠体，对外界环境抵抗力强。

13.细菌L型：有些细菌在某些体内外环境及抗生素等作用下，可部分或全部失去细胞壁，此现象首先由Lister研究发现，故称细菌L 型。

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青霉素·记忆口诀废草溶了长葡萄，白喉破气放心瞧。

勾搭梅毒鼠咬奋，上面还能治流脑。

2.苄星青霉素——预防风湿热;控制链球菌感染。

【记忆口诀】——变脸易得风湿热。

3.半合成青霉素青V耐酸口服好爽，产酶奈苯甲氟氯双。

阿莫氨苄阴阳都强，羧苄哌拉铜绿能抗，阿洛美洛还有替卡。

①天然青霉素——青霉素、普鲁卡因青霉素、苄星青霉素——不耐酸、不耐青霉素酶，抗菌谱较窄;②青霉素V——耐酸的口服青霉素;③甲氧、苯唑、氯唑、双氯、氟氯、萘夫-西林——耐青霉素酶类，对产青霉素酶的金黄色葡萄球菌有较好作用;④氨苄、阿莫-西林——广谱，作用于G+菌以及部分G-杆菌，如大肠埃希菌、奇异变形杆菌、沙门菌属、志贺菌属和流感嗜血杆菌等;⑤羧苄、哌拉、阿洛、美洛、替卡-西林——抗某些G-杆菌包括铜绿假单胞菌。

4.头孢分代一头孢唑林、拉定、氨苄、羟氨苄、噻吩、硫脒二头孢呋辛、孟多、替安、克洛、丙烯三头孢他啶、哌酮、曲松、甲肟、噻肟、克肟、泊肟、唑肟、匹胺、他美、地尼四头孢吡肟、匹罗四代头孢——记忆口诀因为喝了留下米粉，氨苄坐林一定拉肚。

夫妻辛苦替俺克丙，梦多。

三代太多不记啦!四匹骡子比谁更污?5.【引起双硫仑反应的药物·口诀】头孢(7)——哌酮、孟多、替安、匹胺、尼西、甲肟+曲松;7个头孢——派孟多替俺劈了你家曲松!6.第二代大环内酯类抗菌药物——阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素;【口诀】啊!罗红结婚，克拉钻戒!7.抑制细菌蛋白质合成：30而立四环素，红绿林利50载!8.大环内酯类典型不良反应(1)胃肠道反应——呕吐、腹胀、腹痛、腹泻，抗生素相关性腹泻等，严重时难以耐受。

综述：破伤风梭菌破伤风是一种历史较悠久的梭状芽孢杆菌感染，破伤风梭菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生毒素可引起一种急性特异性感染。

破伤风杆菌及其毒素不能侵入正常的皮肤和粘膜，故破伤风一般都发生在伤后，一切开放性损伤都可能引发破伤风。

特征：破伤风梭菌菌体细长，长4～8um，宽0.3～0.5um，周身鞭毛，芽孢呈圆形，位于菌体顶端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。

繁殖体为革兰氏阳性，带上芽孢的菌体易转为革兰氏阴性。

破伤风梭菌为专性厌氧菌，最适生长温度为37℃ph7.0～7.5，营养要求不高，在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徙扩散。

在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。

一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。

对蛋白质有微弱消化作用。

本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽孢抵抗力强大。

在土壤中可存活数十年，能耐煮沸40～50分钟。

对青霉素敏感，硫胺类有抑菌作用。

分布大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，是一种革兰氏染色性厌氧性芽孢杆菌，经伤口感染引起疾病。

于自然界中可由伤口侵入人体，发芽繁殖而致病，但破伤风梭菌是厌氧菌，在一般伤口中不能生长，伤口的厌氧环境是破伤风梭菌感染的重要条件。

窄而深的伤口（如剌伤），有泥土或异物污染，或大面积创伤、烧伤、坏死组织多，局部组织缺血或同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，局部氧化还原电势降低。

有利于破伤风杆菌生长。

破伤风梭菌能产生强烈的外毒素，即破伤风痉挛毒素破伤风。

致病物质及致病机理：破伤风梭菌感染易感伤口后，芽孢发芽成繁殖体，在局部繁殖并释放破伤风痉挛毒素及破伤风溶血素。

前者作用于脊髓前角运动细胞，封闭了抑制性神经介质，导致全身肌肉强直性收缩出现角弓反张（破伤风特有的症状），是引起症状的主要毒素。