2 细胞生物学研究方法 (2)

细胞学说是人类在19世纪的三大发现之一
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
第二节 原核细胞与古核细胞
整个生物界最基本 的类群包括3个域：
原核生物、古核生
物和真核生物
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
一、原核细胞
• 细胞及其组分的分析方法
• 细胞培养与细胞工程 • 细胞及其生物大分子的动态变化
• 模式生物与功能基因组的研究
第一节 细胞形态结构的观察方法
直径 • 病毒 • 支原体 • 细菌 20-200 nm 0.1-0.3 µm 0.5-5.0 µm
• 动植物细胞 20-30 µm
• 活细胞多是无色透明的
细胞学说（Cell theory）
• 1838年，德国植物学家施来登
– 发表论文指出∶植物是由细胞构成的
• 1839年，德国动物学家施旺首次提出细胞学这个 名称，并提出了
◆所有的生物都是由一个或多个细胞组成的 ◆细胞是生命的基本单位
• 1858年，德国医生和病理学家魏尔肖
– 对细胞学说进行了重要补充：一切细胞产自细胞。
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
• 相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加 “环状光
阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差。
• 这是在构造上，相差显微镜不同于普通光学显微镜两个特
殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
λ: 光源波长 N : 介质折射率, 空气为1, 油为1.4 α: 物镜镜口角(样品对物镜镜口的张 角,最大140o,Sinα/2 最大0.94 )
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
二、最小最简单的细胞——支原体
• 最简单的原核细胞，直径为0.1～0.3 μm • 具有细胞质膜，但没有细胞壁 • 环状双螺旋DNA，没有拟核,能指导合成750多种蛋白质;
• 惟一的细胞器是核糖体，每个细胞中约有800～1500个;
• 具感染性,可在培养基上培养; • 培养细胞很容易被支原体污染,污染源主要是血清。
（三）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
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生物分类系统
三界系统 Haeckel 1894 原生生物 Protista 植物 Plantae 动物 Animalia 五界系统 Whittaker 1959 原核生物 Monera 原生生物 Protista 真菌 Fungi 植物 Plantae 动物 Animalia 六界系统 Woese 1977 真细菌 Eubacteria 古细菌 Archaebacteria 原生生物 Protista 真菌 Fungi 植物 Plantae 动物 Animalia 三类生物 Woese 1990 细菌 Bacteria 古细菌 Archaea 真核生物 Eukarya
显微镜观察范围
肉眼观察范围
人眼的分辨率0.2mm，光学显微镜的分辨率0.2μm，而电子显微镜可达0.2nm。
分辨率
• 肉眼 0.2 mm • 光学显微镜 0.2 µm • 电子显微镜 0.2 nm • 扫描隧道显微镜
• 样品制备技术
一、光学显微镜 (light microscope)
• 从细胞的发现、细胞学
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二、细胞学说的建立及其意义
Matthias Jakob Schleiden
Theodor Schwann
Rudolph Carl Virchow
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
来直接观察颗粒物质沿着微
管运输的动态过程
微小区别转化成明暗区别，增加了样
品反差且具有立体感。适于研究活细 胞中较大的细胞器。
Four types of light microscopy
(A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy（光学显微镜） (B) phase-contrast microscopy(相差显微镜) (C) differential-interference-contrast microscopy(微分干涉相差显微镜) (D) dark-field microscopy(暗视野显微镜) 成纤维细胞
正置显微镜与倒置显微镜比较
组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
（三）荧光显微镜—实物
（三）荧光显微镜——基本原理
• 荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到
激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波
长比入射光长)
极端嗜热菌。
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海底烟筒附近也具有古细菌
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部分真题
• 58．（2008，全国卷）原核细胞与真核细胞的不同，表现在： • • A．原核细胞基因组的大小仅有真核生物基因组大小的一半 • B．原核细胞具有单链的DNA分子 • C．原核细胞中与DNA结合的蛋白质较少，而且没有核膜包裹 • D．原核细胞具有RNA．而不是DNA 1.（2017，全国卷）下列没有细胞壁的细胞是： A．细菌 B. 酿酒酵母细胞 C. 蓝藻 D. 支原体
• 89. (2013年全国卷)在研究蛋白质功能时， 常需要知道所研究蛋白质在细胞中的定位 ，比如目的蛋白是否定位于细胞核、细胞 质、线粒体等，可以用哪些方法来确定。 （多选2分） A.免疫荧光标记 • B.GFP标记 • C.原位杂交 • D.免疫电镜 •
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古细菌（archaebacterium）
• 无核膜及内膜系统； • 以甲硫氨酸起始蛋白质合成、核糖体对氯霉素不 敏感、RNA聚合酶和真核细胞的相似、具有内含 子和组蛋白。 • 细胞膜中的脂类不可皂化，细胞壁不含肽聚糖。 • 生活在极端环境中，如：产甲烷菌、极端嗜盐菌、
• 没有典型核结构 • 包括支原体、衣原体、立克 次氏体、细菌、放线菌与蓝 藻等 • 大部分原核细胞主要遗传物 质仅为一个环状DNA • 细胞内没有以膜为基础的各 种细胞器，也没有细胞核膜 • 细胞体积一般很小，直径由 0.2 至 10 μm 不等
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光 学 显 微 镜
（一）普通复式光学显微镜——成像
• 放大的倒立虚像
– 经物镜形成倒立实像 – 经目镜进一步放大成 虚像
（一）普通复式光学显微镜——分辨率
• 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离 • 普通光学显微镜最大分辨率0.2 µm
• 对任何显微镜来说，重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。
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支原体 mycoplasma
• 大小0.2~0.3μm，可通过滤菌器、无细胞壁。 • 细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，凡能作用 于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可 引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。 • 基因组为环状双链DNA，分子量小，合成与代谢 很有限，肺炎支原体寄生于细胞表面。
说的建立，直至今天光
学显微镜仍然是细胞生
物学研究的重要工具
1. 目镜 3. 物镜 5. 反光镜
2. 准焦螺旋 4. 载物台
（一）普通复式光学显微镜——组成
• 由3 部分组成：
– 光学放大系统（目镜 与物镜）
物镜 目镜 光学放 大系统
– 照明系统（光源和 聚光镜） – 镜架及调节系统
机械支持系统 聚光镜 照明 系统 光源
细胞生物学
第一节 细胞学说建立
1590年J. 和Z. Janssen制作 第一台复式显微镜。
1610年Galileo Galilei用显微 镜观察昆虫。
1665年英国人Robert Hooke 出版《显微图谱》。观察了 软木，并首次用cells来描述 “细胞”。
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目镜
450~490nm 蓝光透过
透过波长超过 510nm的光
反射波长低于 510nm的光
物镜
激发滤光片
样品
（三）荧光显微镜——样品制备
• 免疫荧光技术 • 荧光素直接标记技术
• 绿色荧光蛋白(GFP)的 基因与编码某种蛋白质 的基因相融合表达
• 两种以上荧光素标记同 一样品，可同时显示不 同成分在细胞中的定位
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