第四章分子生物学研究法修定版(13年)

可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。

因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。

事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。

本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。

5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。

但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。

事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。

因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。

术史上最重要的事件。
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（一）限制性内切酶(RE)
1、概念：一类能识别和切割双链DNA分子中特 异核苷酸序列的DNA水解酶。
2、分类： I型 、II型 、Ⅲ型
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类型I：识别的DNA序列长约十几个bp；酶 切位点在距识别位点1kb左右处随机切割，非特 异性；复合酶，无使用价值。
第七章 分子生物学研究方法
第一节 重组DNA技术回顾 第二节 DNA基本操作技术 第三节 RNA基本操作技术 第四节 SNP的理论与应用 第五节 基因克隆技术 第六节 蛋白质组与蛋白质组学技术
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第一节 重组DNA技术回顾
一、重组DNA技术发展史上的重大事件
第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带 者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质， 解决了遗传的物质基础问题；
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重组DNA技术（recombination）： 是应用酶学方法，在体外将不同来源的
DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成 杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行 扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
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工具酶： 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） DNA连接酶（DNA ligase） 工具酶的发现和应用是现代生物工程技
目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和 电转化法。
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感受态细胞的制备—氯化钙法
第一次摇菌 第二次摇菌 离心收集细菌 0.1M CaCl2 重悬细胞 , 冰浴30 min 离心、重悬重复一次
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凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内 切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的 双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后， 再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化 DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生 一次磷酸二酯键断裂。
b. 转录激活域(Transcriptional activation domain, AD)，它通过与转录机器(transcription machinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下 游基因进行转录。
酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的。
总结：酵母双杂交系统是一项研究蛋白质之间相互作用
的实验技术。其系统组成及原理如下：GAL4蛋白是酵母的转 录激活因子，具有DNA结合结构域（DNA binding domain， BD；位于氨基端1～147氨基酸）和转录激活结构域 （transcriptional activating domain，AD；位于羧基端 768～881氨基酸）。为了研究已知蛋白X与未知蛋白Y之间是 否能够相互作用，则将GAL4的BD编码区cDNA与蛋白X的cDNA 按正确的ORF阅读框连接在一起，构建一重组质粒；同理， 将GAL4的AD的cDNA与蛋白Y的cDNA连接在一起，构建另一重 组质粒。将两种质粒共转化工程酵母菌（其编码GAL4的基因 已缺损），则二者分别表达融合蛋白“BD-X”（“诱饵”， bait）和“AD-Y”）（“猎物”或靶蛋白，prey or target protein)。若蛋白X和Y二者之间在酵母细胞核内能够发生相 互作用，则相当于将原来已拆开的BD和AD又连在了一起， GAL4的活性被恢复，识别并结合于特异的DNA调控元件上，

一．名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。

这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。

NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。

一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。

可分为单一型NLS和双分型NLS。

单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。

SUMO（small ubiquitin-related modifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。

SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。

SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。

二．问答题1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。

特性：①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。

②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。