结核病实验室诊断技术进展

结核病实验室诊断技术进展 结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其发病规律和流行特点决定了在今后相当长的时期内其危害将持续存在。结核病被列为我国重大传染病之

一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。世界卫生组织的统计资料显示，

约三分之一的世界人口曾经感染结核菌，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。

据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，我国

是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行

严重的国家之一。目前我国三分之一左右的人口已感染了结核菌，受感染人数超

过4亿。据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核病。我国现有

肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群；每年约有13万人死于结核

病，死亡平均年龄为55.2岁。如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我

国可能有近5000万的感染者发生结核病。

历年来全国结核病流行病学调查结果显示，全国肺结核患病率继续呈现下降

趋势。特别是传染性肺结核患病率下降尤为明显，由2000年的122/10万下降到

66/10万，十年降幅近50%。

结核分枝杆菌从分类上看是分枝杆菌科、分枝杆菌属中引起人类患病最多的

致病菌。结核病实验室检查，尤其是细菌学检查是结核病诊断的最主要和最基本

技术，也是选择治疗方案、考核疗效、评价防治效果的主要指标。

目前结核病实验室检查技术包括：全菌体为基础的病原微生物学检测、细菌

核酸为靶标的分子生物学检测和机体免疫相关反应及其产物的检测。

一、全菌体为基础的病原微生物学检查技术

与其它传染性疾病相同，从检测原理和临床检验目的上，结核病的病原微生

物学检查，分为基于形态学的显微镜镜检、基于微生物表型的分离培养、药物敏

感性实验和菌种鉴定实验。

1. 分枝杆菌形态学检查——抗酸染色镜检：是结核病临床诊断最基本的方

法之一，简单快速，在不考虑生物安全防护的前提下，２-４小时即可发报告，

对于结核病的诊断、指导和评价临床用药具有重要意义。

从玻片制备操作流程的角度，抗酸染色可分为直接涂片和集菌涂片两种，其

中直接涂片应用最为广泛。按照抗酸染色使用染料的性质和镜下成像原理，抗酸

染色可分为萋-尼氏染色（Ziehl-Neelsen staining）和荧光染色（fluorescent

staining）。使用石碳酸复红染料的萋-尼氏染色镜检是经典的抗酸菌检测方法，

目前国内外多数实验室仍然依靠此方法进行结核检测，但其灵敏度较低，仅

20%~30%；以金胺O、罗丹明为代表的荧光染色法提高了镜检的灵敏度，并使读

片时间大大缩短。但由于荧光显微镜昂贵的价格，限制了其在基层的应用。

近年随着发光二极管（light emitting diodes，LED）与荧光显微镜技术结

合，研发的发光二极管荧光显微镜较普通荧光显微镜有诸多优势：LED灯泡不需

要定期维护，寿命约为50000h，光的强度容易调节，甚至可以转为荧光。LED

的蓝光柔和背景与目标对比鲜明，不易产生视觉疲劳；使用LED不用担心汞蒸气

对身体的伤害；无需提前打开光源预热，并且在读片的过程中显微镜没有热量产

生。在对周围环境的要求上，LED没有光线及暗室的要求，在一个光线微弱的环

境中就可以读片。鉴于LED显微镜操作简单，价格低廉，具有高敏感性和特异性， 读片所用的时间及视野都较萋尼抗酸染色法有很大优势，WHO推荐LED荧光显微

镜作为常规光学显微镜的代替。

尽管涂片镜检具有简便、快速、成本效益比高等特点，但是作为活动性肺结

核诊断的“标准”，其敏感性和特异性的差异却很大，特别是无法区分死菌和活

菌。另外传统抗酸染色对于细胞壁缺失型（L型）结核分枝杆菌的检查效果不理

想，虽然曾改良染色法检查，如IK（intensified Kinyouns）抗酸染色、三联

染色法（FFCT）、米塔尼尔黄改良法等，但因检出率仅为26%～37.4％，且特异

性不稳定，导致实际应用受到影响。

基于形态学的检查除了用于肺结核的诊断外，显微镜观察药敏分析

（microscopic observation drug susceptibility，MODS）也是一项低成本的

药敏分析技术。该技术依据结核分枝杆菌在液体培养基中生长时形成索状结构，

采用倒置显微镜观察索状结构可用于结核分枝杆菌的快速诊断，对比含有和不含

有药物培养孔内的生长情况，即可得出“敏感”或“耐药”的结果。研究报道显

示，MODS 对四种药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇) 的药敏试验结果，

与现有分枝杆菌药敏实验检测系统得出的结果能很好地吻合。但是，有些结核分

枝杆菌并不形成蜿蜒的索状微菌落，而且堪萨斯分支杆菌在营养培养基中也能形

成类似的索纹结构，难以和结核杆菌区别开来。另外，在牛结核高流行国家，如

何区分牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，也是一个问题。此外，实施 MODS 和其它的

培养鉴定新技术，主要的困难还在于生物安全性。痰液样本的消化、去污染与离

心浓缩同时进行，而离心过程肯定会产生含菌气溶胶。另外，操作带菌的细胞培

养板，也有潜在风险，必须在生物安全柜内进行。因而实施这种“便宜”的测试

也必须在符合生物安全要求的实验室完成。

2. 分枝杆菌传统培养（或称固体培养）：由于分枝杆菌的生长繁殖对营养

要求较高，多年来广泛使用的是罗氏鸡蛋培养基和Middlebrook 7H11琼脂培养

基。结核分枝杆菌培养结果仍是目前诊断肺结核的金标准。尤其是分离培养结果

与镜检方法结合，能够鉴定目标菌的活力程度，该特点在耐药性检测并指导临床 用药等方面具有重要作用。但由于结核分枝杆菌的生物学特性，决定了传统的罗

氏培养需要4~8周才能判定结核分枝杆菌是否生长，导致了检验结果无法满足临

床诊疗活动实效性的矛盾。

为解决传统固体培养检查检验结果实效性的问题，2000年后出现了变色培

养基测定法。此方法具有培养和药物敏感性检测的双重功能。其原理是在固体培

养基中加入氧化还原显示剂无色四氮唑盐（Tetrazole），当有分枝杆菌生长时，

分枝杆菌氧化还原系统将培养基中的无色四氮唑盐还原成不溶于水的紫红色物

质，并以颗粒形式分泌至细胞表面，从而使结核分枝杆菌菌落变成肉眼可观察到

的红色或紫色菌落。变色培养基法阳性结果报告时间平均为10天左右；与罗氏

培养基比较阳性率提高约10%～15%，且操作简便，不需要昂贵大型仪器设备，

适于在发展中国家和贫困地区推广应用。在实际应用过程中，变色培养法存在阳

性率不高，结果判断易带主观性，且变色存留时间较短，仅2～3天紫色即消失，

需及时观察结果等问题。

虽然培养法的敏感性、特异性高于抗酸染色镜检，但阳性率也只有30%~40%。

同时，由于各种分枝杆菌均可生长，要确定培养阳性结果是否为结核菌，仍需结

合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。

以生物表型特性培养为基础的分枝杆菌药物敏感性试验和菌种鉴定实验，对

于结核病人合理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有

积极的作用。特别是结核病耐药性监测可以为评估制定国家结核病控制规划和控

制策略提供科学依据。

绝对浓度发药敏试验是60年代以来结核病实验室特别是医院的实验室用于

结核分枝杆菌药敏试验的常用方法，其原理是接种同一浓度的菌液在两支不同浓

度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落

的数量，根据含药培养基上菌落生长的数量，确定测试菌株对该药的耐药性。比

例法药敏试验是1996年世界卫生组织在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实 验室用于耐药性检测的方法。其原理是接种两种不同浓度的菌液在两支同一浓度

的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的

数量，计算耐药百分比，确定测试菌株对该药的耐药性。无论是比例法还是绝对

浓度法，都需要1个月时间报告药敏结果。

分枝杆菌菌种鉴定需要经过一系列生物表型实验，如：对硝基苯甲酸（PNB）

生长试验、28℃生长试验、细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色，以及耐热触

酶试验、硝酸还原等分枝杆菌酶学实验，待测菌株菌体高效液相色谱-质谱组分

分析（HPLC-MS）来确定该菌株属于结核分枝杆菌。

3. 分枝杆菌生长指示管（mycobacteria growth indicator tube，MGIT）

系统：也被称为快速培养或液体培养。BD公司开发的MGIT-960系统、生物梅里

埃公司BacT/ALERT 3D是第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统。目前的检测

系统解决了此前Bactec TB-460存在的放射性污染问题，并保留了其快速的优点，

使结核病细菌学检查方法有了进一步发展。其基本原理是培养瓶底部含有包被于

树脂上的荧光显示剂。由于该显示剂具有氧抑制性，当分枝杆菌生长消耗氧后，

荧光显示剂被激活而发出荧光。通过检测系统定期连续测定培养管内荧光强度，

判断管内分枝杆菌生长情况。该培养仪可用于痰、支气管灌洗液、胸水、腹水、

脑脊液、尿液、脓液、关节液、病灶组织或干酪样块等各种临床标本的分枝杆菌

培养、初步菌种鉴定和药物敏感试验。国内外应用结果表明，该系统用于分枝杆

菌培养，在阳性率、阳性结果报告时间显著高于传统固体培养法，且自动化程度

更高、操作更为简便。阳性标本检出时间平均为9天；结核分枝杆菌菌群鉴定、

药敏试验时间平均为7天；阳性标本检出率比固体培养方法提高10.77%。

4.噬菌体裂解试验：检测原理是结核分枝杆菌特异性噬菌体可进入活的结核

分枝杆菌使其感染，随后加入杀毒剂灭活未进入感染菌体内的噬菌体。进入菌体

内的噬菌体在感染菌体内大量增殖，并裂解菌体，释放出的子代噬菌体可感染并

裂解随后加入的指示细胞，从而在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。因此，只要根

据噬菌斑的有无及其多少就可判断待检标本中是否存在活的结核分枝杆菌。由于