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血管内皮细胞生长因子受体Flt-1结合小肽的融合表达及活性鉴定雷和田;吴健;杨峻山;寿成超【期刊名称】《中国生物化学与分子生物学报》【年(卷),期】2002(18)1【摘要】血管内皮细胞生长因子 (VEGF)通过结合其酪氨酸激酶受体KDR、fms 样酪氨酸激酶 1(Flt 1)调节新生血管形成 ;筛选能封闭VEGF结合Flt 1的小肽 ,可以通过阻断肿瘤血管形成 ,抑制实体瘤生长 .将从噬菌体 12肽库中筛选获得的 2个能与Flt 1结合的阳性噬菌体克隆 (F5 6和F90 )十二肽DNA(36bp)克隆到表达载体pQE4 2中 ,在大肠杆菌M15中稳定表达二氢叶酸还原酶融合蛋白(DHFR F5 6 F90 ) ,经变性、复性后得到纯度达 90 %的可溶性蛋白 .ELISA检测表明 ,DHFR F5 6 F90能结合可溶性受体sFlt 1和血管内皮细胞 ;12 5I VEGF竞争抑制实验显示 ,DHFR F5 6能竞争抑制VEGF同可溶性受体sFlt 1结合 .结果提示 ,F5 6可能是VEGF受体Flt 1的有效拮抗剂。
【总页数】4页(P19-22)【关键词】血管内皮细胞生长因子受体;VEGFR;小肽;VEGFR-1;拮抗剂;融合表达;活性鉴定【作者】雷和田;吴健;杨峻山;寿成超【作者单位】北京大学临床肿瘤学院,北京市肿瘤研究所;中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所【正文语种】中文【中图分类】R394.8;Q463【相关文献】1.胃癌组织血管内皮细胞生长因子及其受体Flt-1的表达及与胃癌生物学行为的关系 [J], 王元宇;叶再元;赵仲生;陶厚权2.短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进 [J], 安平;寿成超;孟麟;董志伟3.人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定[J], 马骊;张智清;周小明;曾革非;陈爱君;姚立红;王小宁4.人可溶性血管内皮细胞生长因子受体Flt-1基因在链霉菌中的克隆表达 [J], 姜自彬;李元5.血管内皮生长因子受体Flt-1结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究 [J], 雷和田;寿成超;吴健;刘晓颖;何洛文;刘美生;郭琦;姜北海因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血管内皮细胞生长因子及其受体研究进展毛华;陈宏;袁爱力【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】1999(005)006【摘要】@@ 1983年Senger等[1]发现用癌性腹水作Mile试验,可使豚鼠皮肤对美兰的通透性增加.并且在癌性腹水和肿瘤细胞培养上清液中分离、纯化出可使微血管与小静脉血管通透性增加的活性物质,称作血管通透因子(Vascular Permeability Factor,VPF)[1,2].后来发现该因子特异性作用于血管内皮细胞,并促进血管内皮细胞的增殖,因此又称血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF).实验和临床研究发现,实体肿瘤在血管未形成时,肿瘤的增殖、生长有限,几乎不发生肿瘤转移.肿瘤诱发宿主微血管内皮细胞增殖,形成微血管时肿瘤细胞迅速增加,肿瘤体积增大,并且具有潜在转移倾向.因此,VEGF与肿瘤生长和转移的关系越来越受到关注.本文就VEGF的理化性质、生物学功能的研究近况简要概述.【总页数】2页(P241-242)【作者】毛华;陈宏;袁爱力【作者单位】第一军医大学南方医院全军消化研究所,广州,510515;第一军医大学南方医院全军消化研究所,广州,510515;第一军医大学南方医院全军消化研究所,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.血管内皮细胞生长因子及其受体与血管形成的研究进展 [J], 刘文忠;付小兵;张宝林2.小分子血管内皮细胞生长因子受体激酶抑制剂研究进展 [J], 刘文虎;曹弟勇;刘毅3.血管内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的研究进展 [J], 钟毅;李志裕;尤启冬4.以血管内皮细胞生长因子及其受体为靶点的抗肿瘤治疗研究进展 [J], 李琳;裴银辉5.血管内皮细胞生长因子及其受体在肝癌转移中的研究进展 [J], 蔡雪军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肾细胞癌中血管内皮生长因子受体的表达与肿瘤侵袭的关系张秀英;李玉林;李一雷;朱桂彬
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2004(030)005
【摘要】目的:探讨肾细胞癌中血管内皮生长因子(VEGF)受体flt-1的表达与肿瘤生物学行为的关系.方法:采用免疫组织化学和形态半定量方法检测34例肾细胞癌中flt-1的表达水平.结果:flt-1的表达与肾细胞癌患者肾静脉内有无瘤栓形成有密切关系(P<0.05).结论 :flt-1表达与肾细胞癌生物学行为有关.
【总页数】3页(P745-746,761)
【作者】张秀英;李玉林;李一雷;朱桂彬
【作者单位】吉林大学基础医学院病理解剖学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院病理解剖学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院病理解剖学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院病理解剖学教研室,吉林,长
春,130021
【正文语种】中文
【中图分类】R737.11;R730.21
【相关文献】
1.血管内皮生长因子受体在骨巨细胞瘤中的表达及其与肿瘤增殖和血管生成关系的研究 [J], 杨宣涛;张贤良;步宏;成娘;陈代云
2.血管内皮生长因子受体在肾细胞癌组织中的表达 [J], 杨绍波;孔垂泽
3.肺癌组织中血管内皮生长因子受体的表达及其与转移和预后的关系 [J], 项锋钢;马桂馨
4.血清可溶性血管内皮生长因子受体1在子宫内膜癌患者中的表达及与疾病特征的关系 [J], XIAO Hong;GUO Jian;PAN Xiaolei
5.肺癌组织中血管内皮生长因子受体Flt1及KDR的表达及其与肿瘤转移和预后的关系 [J], 项锋钢;马桂馨
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血管内皮生长因子与肿瘤侵袭转移龚晓燕，保永亮，黄金玲(安徽中医学院，安徽合肥230038)关键词：VEGF；血管生成；血管通透性；淋巴管生成；侵袭转移；调控因子血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF），也称血管渗透因子（Vascular Permeability Factor，VPF），是一种以二硫键相连的二聚体糖蛋白化合物。
近年来，关于VEGF参与肿瘤生长、转移过程的研究备受关注，本文对VEGF与肿瘤侵袭转移的研究综述如下。
1VEGF及其受体1．1VEGF家族1983年Senger等［1］从豚鼠转移模型的腹腔渗液和多种肿瘤细胞培养液中分离得到一种蛋白因子，发现它可以诱导血清蛋白由血管渗漏而不引起血管内皮细胞的损伤，并将其称为血管渗透因子（VPF）。
之后Ferrara等［2］又从牛垂体滤泡细胞培养液中分离纯化，发现其具有促进内皮细胞有丝分裂的作用，首次将其称为VEGF。
之后，又有多种与VEGF结构和功能类似的蛋白被发现，被共同归属于VEGF 家族。
目前己知的VEGF家族由7个成员组成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F以及胎盘生长因子（Placenta Growth Factor，PIGF）。
VEGF-A是最早被发现的，而且在组织和细胞中含量最为丰富，功能最强，因而现在多数文献中的VEGF即指VEGF-A。
VEGF-A的编码区域由8个外显子和7个内含子组成，人类VEGF-A通过选择性剪切产生四类蛋白异构体，并根据其氨基酸数不同称为VEGF-A121，VEGF-A165，VEGF-A189和VEGF-A［3］206。
VEGF-A具有增加血管通透性，促进内皮细胞增殖，促进血管生成的功能，被认为是影响血管生成最有力的因素，其中，VEGF-A165在血管生成的过程中起着关键的作用［4］。
VEGF-B由7个外显子和6个内含子组成，在血管生成的过程中可起到促进作用。
血管内皮生长因子VEGF及其受体Flt-1在人脑星形细胞瘤中的表达杨东波;杨立庄;李永利;郑永日;康军;叶伟【期刊名称】《中国神经精神疾病杂志》【年(卷),期】2003(029)001【摘要】目的检测血管内皮细胞生长因子VEGF及其受体flt-1在人脑星形细胞瘤中和正常脑组织的表达,分析二者表达程度与脑星形细胞瘤病理分级的关系.方法采用免疫组织化学的方法,对33例脑星形细胞瘤组织和7例正常脑组织VEGF和Flt-1的表达情况进行了观察.结果VEGF在Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型脑星形细胞瘤之中阳性率分别为11%、50%、75%和75%,而正常成人脑组织无VEGF表达,脑星形细胞瘤与正常成人脑组织VEGF表达有显著性差异(P＜0.01).7例正常成人脑组织未见Flt-1表达,脑星形细胞瘤Flt-1表达率分别为0、17%、50%和100%,限于肿瘤血管的内皮细胞表达.肿瘤细胞VEGF表达与Flt-1表达呈正相关(r=0.7376,P ＜0.001),无论VEGF还是Flt-1在坏死区周围表达都明显增强.结论VEGF及其受体Flt-1在人脑星形细胞瘤和正常脑组织的表达有显著性差异,与脑星形细胞瘤病理分级有关.【总页数】2页(P63-64)【作者】杨东波;杨立庄;李永利;郑永日;康军;叶伟【作者单位】哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科,哈尔滨,150089;哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科,哈尔滨,150089;哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科,哈尔滨,150089;哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科,哈尔滨,150089;哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科,哈尔滨,150089;哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科,哈尔滨,150089【正文语种】中文【中图分类】R739.41【相关文献】1.人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究 [J], 马骊;王小宁;张智清;周小明;曾革非;陈爱君2.血管内皮生长因子及受体Flt-1在膀胱癌中的表达及意义 [J], 李道兵;罗旭;李春鸣;刘华庆3.血管内皮生长因子及其受体Flt-1、KDR在胃癌组织中的表达及意义 [J], 罗祥东;辛彦;肖玉平4.VEGF-C及其受体VEGFR-3在不同级别脑星形细胞瘤中的表达 [J], 叶秀峰;钟雪云;米粲;吴赤蓬5.血管内皮生长因子与其受体FLT-1、FLK-1/KDR在非小细胞肺癌中的表达及临床研究 [J], 黄宝贤;陆国华;周建英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血管内皮生长因子及其受体在肺癌组织中表达的研究颜浩;徐淑晖;周黎强;章培;黎怀碧【期刊名称】《中国呼吸与危重监护杂志》【年(卷),期】2005(4)3【摘要】目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flt 1及Flk 1/KDR)与肺癌临床指标及预后的关系。
方法收集6 0例原发性支气管肺癌标本及10例正常肺组织,应用免疫组化方法检测肺癌组织及正常肺组织VEGF、Flt 1及KDR的表达。
结果肺癌组织VEGF、Flt 1及KDR的表达较正常肺组织增强,阳性率分别为6 1 6 %、4 6 6 %及6 0 0 %。
VEGF、Flt 1及KDR在肺癌细胞、血管内皮细胞、间质成纤维细胞均呈阳性表达,以癌细胞表达最强。
VEGF及KDR表达在不同淋巴结转移及临床分期之间存在显著性差异。
肺癌组织VEGF和KDR的表达具有相关性及一致性。
CoxRegression风险比例模型分析提示VEGF表达程度为影响肺癌患者预后的指标。
结论VEGF可由肿瘤细胞、血管内皮细胞、间质成纤维细胞等多种细胞产生。
VEGF和KDR在肺癌淋巴结转移及临床分期中起重要作用,VEGF可作为肺癌患者判断预后的可靠指标。
【总页数】4页(P189-192)【关键词】血管内皮生长因子;受体;肺癌组织;基因表达;VEGF;肿瘤;免疫组化;纤维细胞【作者】颜浩;徐淑晖;周黎强;章培;黎怀碧【作者单位】成都市第二人民医院呼吸内科;成都市第二人民医院病理科【正文语种】中文【中图分类】R734.2【相关文献】1.非小细胞肺癌组织中内皮抑素、血管内皮生长因子受体的表达 [J], 王世君;夏曙华;谢婷婷;张燕;郑琳2.表皮生长因子受体、血管内皮生长因子受体和BAD在非小细胞肺癌中的表达[J], Zhaolin Xu;Drew Bethune;Sen Rong Yan;Neale Ridgway;罗晓阳3.雷公藤多苷对胶原诱导性关节炎大鼠组织中血管内皮生长因子及血管内皮生长因子受体2mRNA表达水平的影响 [J], 韩曼丽;章金春4.表皮生长因子受体及血管内皮生长因子在非小细胞肺癌组织中的表达 [J], 代先慧;蒋捍东5.非小细胞肺癌组织中表皮生长因子受体和血管内皮生长因子的表达及临床意义[J], 赵学维;孙光远;李兵;徐志飞;何金;刘惠敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血管内皮生长因子在肿瘤免疫中的抑制作用王健;马鸿达【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2004(000)0S1【摘要】众所周知,血管内皮生长因子(vascularendothelialcellgrowthfactor,VEGF)是内皮细胞生长和血管生成的缺氧诱导刺激因子[1],在生理和病理过程中能增加血管的通透性,促进血管形成。
目前,VEGF在肿瘤的生长和转移过程中的重要作用已得到广泛研究。
然而其在肿瘤免疫中的作用谈之较少,这主要是通过VEGF抑制抗原呈递细胞树突状细胞(dendriticcell,DC)的分化成熟而实现的[2]。
1VEGF分类及主要生理作用VEGF属于血小板源生长因子(PDEF)家族,是两个酪氨酸激酶受体VEGFR -1(Flt -1)和VEGFR -2(KDR/Flk -1)的配体,前者主要表达于单核细胞而后者主要在内皮细胞表达[3]。
VEGFR -3也是酪氨酸激酶的受体,结构同前两个相似但不结合VEGF ,它最初表达于胚胎内皮,在发育过程中血管内皮的表达逐渐减少而主要表达于成人组织的淋巴管内皮。
VEGFR -3的两个配体,是蛋白分解过程中形成的多肽组成二硫化物连接的二聚物,与VEGF有高度的同源性,因而分别命名为VEGF -C和VEGF -D[4]。
尽管VEGF -C能与表达于血管内皮的VEGFR -2...【总页数】3页(P)【作者】王健;马鸿达【作者单位】天津医科大学病理教研室;天津医科大学病理教研室;天津【正文语种】中文【中图分类】R730.3【相关文献】1.改良内皮抑素基因对大鼠角膜新生血管中血管内皮生长因子及其受体表达的抑制作用 [J], 葛红岩;肖楠;田霈;王琳;罗鑫;刘平2.改良内皮抑素基因对大鼠角膜新生血管中血管内皮生长因子及其受体表达的抑制作用 [J], 葛红岩;肖楠;田霈;王琳;罗鑫;刘平3.血管内皮生长因子干扰RNA对鼠视网膜中血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用 [J], 王育科;夏晓波4.缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mRNA表达及金雀异黄素的抑制作用 [J], 袁志兰;周青;王斌;戈应滨;袁孝如5.肝癌微环境中FOXP3+调节性T细胞对肿瘤免疫抑制作用的研究 [J], 韩丽芳;赵昌林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
・论著・基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(39525021);国家“863”高技术研究发展计划基金资助项目;北京市科委及北京市高技术实验室资助项目作者单位:100034北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所生物化学与分子生物学研究室通讯作者:寿成超(电话:010*********,E 2mail :cshou9@ )血管内皮生长因子受体Flt 21结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究雷和田 寿成超 吴健 刘晓颖 何洛文 刘美生 郭琦 姜北海 【摘要】 目的 检测从十二肽库中筛选获得的能与血管内皮细胞生长因子(VEG F )受体Flt 21结合的小肽的生物学活性。
方法 免疫细胞化学方法检测小肽融合蛋白DHFR 2F56/F90与人脐静脉内皮细胞的结合活性;鸡胚尿囊膜血管增生抑制实验检测DHFR 2F56/F90能否抑制鸡胚新生血管形成;裸鼠成瘤实验检测DHFR 2F56/F90对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制;免疫组织化学方法检测DHFR 2F56/F90能否定位于肿瘤组织。
结果 小肽融合蛋白DHFR 2F56/F90能与人脐静脉内皮细胞结合,DHFR 2F56能抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成,且DHFR 2F56能与肿瘤细胞结合,促进肿瘤组织坏死及显著抑制肿瘤生长。
结论 十二肽F56是VEG F 结合Flt 21的有效拮抗剂,具有抑制VEG F 诱导的新生血管形成而抗肿瘤生长和转移的潜在应用前景。
【关键词】 内皮,血管; 受体,生长因子; 肽库; 肿瘤I nhibition of tumor grow th by a peptide fusion protein binding to vascular endothelial grow th factor receptor F lt 21 L EI H etian ,SH OU Chengchao ,WU Jian ,LIU Xiaoying ,HE Luowen ,LIU Meisheng ,G UO Qi ,JIANG Beihai.Peking Univer sity School o f Oncology ,Beijing Institute for Cancer Research ,Beijing 100034,China【Abstract 】 Objective Investigating the bio 2activities of peptides selected from phage display peptide library with vascular endothelial growth factor receptor Flt 21.Methods Activities of DHFR 2F56/F90binding to human ubilial vein endothelial cells were detected by immunocytochemistry ,and the activity of antiangiogenesis was determined with chick embry o chorioallantoric membrane (C AM )assay.Balb/c nude mice were used as m odel to detect the activity of DHFR 2F56/F90on inhibiting tum or growth ,and immunohisto 2chemistry was employed to determine the localization of the DHFR 2F56/F90in tum or.R esults DHFR 2F56/F90can bind to H UVEC ,and DHFR 2F56inhibite angiogenesis in C AM.Meanwhile DHFR 2F56can bind with tum or cells ,induce tum or necrosis and inhibit tum or growth in viv o.Conclusion The peptide F56is an effective antag onist of VEG F binding to Flt 21and has a potent utility in antiangiogenesis and inhibiting tum or growth.【K ey w ords 】 Endothelium ,vascular ; Receptors ,growth factors ; Peptide library ; Neoplasm 新生血管形成在实体瘤迅速生长时起关键作用[1]。
实体瘤长至一定体积后,因缺氧常诱导肿瘤细胞分泌一些促血管形成因子,包括血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEG F ),刺激宿主血管内皮细胞分裂及诱导新生血管向肿瘤组织延伸[2,3]。
VEG F 在促进肿瘤新生血管形成、肿瘤生长及转移过程中起着重要作用。
抗VEG F 单克隆抗体能抑制肿瘤生长和转移,用反义核苷酸抑制VEG F 的表达,可导致实体瘤缩小[4,5]。
大量研究表明,VEG F 受体K DR/F LK 21是血管内皮细胞增殖所必要的,而VEG F 受体Flt 21(fms 2like tyrosine )是新生血管形成所必需。
Flt 21与VEG F 的亲和力比K DR 高10至100倍[6,7]。
促进肿瘤细胞可溶性Flt 21的表达能抑制实体瘤的生长、抑制转移灶的形成及延长宿主的生存时间[8]。
因此,VEG F 及其受体Flt 21已成为近年通过抗肿瘤血管形成治疗癌症的重要研究靶点。
利用噬菌体肽库技术筛选与靶分子特异结合的活性小肽,是近年用于药物研发的重要手段,并有获得成功的报道,如拮抗整合素与细胞粘附分子结合及VEG F 与受体K DR 结合的小肽的筛选[9,10]。
它们均能通过不同机理抑制肿瘤血管的生成。
我们在既往的工作中以VEG F 受体Flt 21为靶分子,通过生物淘筛(Bio 2panning )从噬菌体展示十二肽库中筛选获得了两个能与Flt 21结合的阳性克隆F56、F90[11]。
为了进一步验证其结合活性,我们根据小肽氨基酸序列合成了相应的核苷酸片段,然后将其构建到二氢叶酸还原酶(DHFR)原核表达载体上,其表达的融合蛋白(DHFR2F56)经检测具有阻断VEG F与Flt21结合、抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成及荷瘤裸鼠的肿瘤生长等生物学活性,具有潜在的临床应用前景。
材料与方法1.材料:人脐带标本取自北京妇产医院,RPMI 1640、胎牛血清与胶原酶Ⅱ来源于GI BC O BR L公司,人源VEG F165购于Sigma公司。
人胃癌803细胞系由本实验室保存提供;DHFR和DHFR2F56/F56由本室制备,电泳纯达90%以上[12];3H2TdR购自中国科学院原子能研究所;种鸡蛋来自北京丰台种鸡场;5周龄雌性BA LB/c裸鼠购于中国医学科学院实验动物所;32氨丙基2三乙氧基甲硅烷(APES)购自北京中山生物技术有限公司,使用时用丙酮1∶50稀释;30% H2O2购自北京中山公司;过氧化物酶缀合链霉亲和素(LABE L)与M U LTI LI NK(针对小鼠、大鼠、兔、豚鼠抗体的生物素化免疫球蛋白)为BioG enex产品;闪烁液(PPO2.0g;POPOP0.25g;二甲苯500ml),D2 Hanks溶液(NaCl8.0g,K Cl0.4g,Na2HPO4・12H2O 0.12g,KH2PO40.06g,无水葡萄糖1.0g,1%酚红2ml,加去离子水至总体积1L)为本室自行配置。
2.免疫细胞化学检测:无菌条件下取新生儿脐带标本,用0.1%胶原酶Ⅱ消化后,离心(800r/min, 10min)收集人脐静脉内皮细胞(H UVEC),用20%胎牛血清(FCS)/RPMI1640悬浮后,移入塑料瓶,置于C O2孵箱中培养(37℃,5%C O2)。
0.04%胰酶/ E DT A消化培养原代脐静脉内皮细胞,待细胞变圆时,用培养液终止消化,悬浮贴壁细胞;计数,按2×104细胞/孔加入48孔培养板中培养24h。
弃掉培养液,用冷丙酮/甲醇(1∶1)固定细胞10min后用P BS浸洗;经用3%H2O2/P BS处理10min,以除去内源性过氧化物酶,10%羊血清/P BS封闭,分别加入二氢叶酸还原酶(DHFR)2F56/F90及DHFR(5μg/ml),37℃,1h后常规加入抗DHFR单克隆抗体为一抗,并按试剂盒说明书依次加入酶标二抗及底物显色液,显微镜下观察,摄影。
3.鸡胚绒毛尿囊膜血管增生抑制实验:把新鲜的授精后鸡蛋在38℃、0.1%新洁尔灭溶液中浸泡2min后,放入37.5℃、60%～70%湿度的孵箱中孵化3d,去掉鸡蛋外壳移入平皿培养;待尿囊膜长至约1cm2时分组加药,每组5个鸡胚,将VEG F165(2μg/L)、DHFR及DHFR2F56/F90溶液18μl(0.8μg/μl)分别滴于直径5mm的玻璃纤维滤膜上,并将其置于绒毛尿囊膜的远心端,早晚各1次连续加药2d,观察结果并摄影记录。
重复2次。
4.裸鼠成瘤抑制实验:从中国医学科学院动物中心购买5周龄的BA LB/c裸鼠12只,在右臀部皮下接种人胃癌MG C803细胞,每只裸鼠接种2×106细胞(0.1ml),接种后第5d,随机分成3组,每组4只,腹腔内分别注射DHFR、DHFR2F56/F90,每次150μg/100μl,隔日给药,共10次。
停药后继续观察30d,期间每隔2d用游标卡尺量瘤的长短径,并按公式1/2×长径×短径2计算瘤块的体积。
30d后,断颈处死裸鼠,摄影记录,并取瘤称重进行统计学分析。
且将瘤块固定于10%的甲醛溶液中,用于后续实验。
5.肿瘤组织观察:将瘤块常规固定,石蜡包埋、切片。
切片经HE染色后显微镜下观察。
6.免疫组织化学检测:用DHFR抗体对上述肿瘤组织切片进行常规免疫组化检测。
结果1.小肽F56、F90与血管内皮细胞结合情况:用细胞组织化学实验表明,DHFR2F56和DHFR2F90均能与脐静脉内皮细胞结合,而DHFR与内皮细胞不结合(图1)。
说明DHFR2F56和DHFR90与内皮细胞的结合是通过小肽实现的。
2.DHFR2F56抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的增生情况:实验结果显示,未经任何处理或经VEG F、经DHFR290(A)和DHFR256(B)和处理的细胞有棕黄色着染,而DHFR处理组细胞(C)未见明显着染 ×400图1 免疫细胞化学检测小肽融合蛋白与人脐静脉内皮细胞的结合DHFR 处理的瘤组织血管分布较多(A );DHFR 2F56处理的瘤组织血管较少,且瘤组织坏死较严重(B )×250图5DHFR 2F56促进肿瘤组织坏死DHFR 2F56处理组肿瘤明显小于DHFR 对照组,且肿瘤表面均有坏死形成的发黑干痂图4不同给药组在停药30d后的荷瘤状况图3不同给药组BA LB/c裸鼠肿瘤的生长曲线A 1VEG F 刺激血管增生明显;B 1未作任何处理的鸡胚血管;C 1单纯DHFR对血管无明显影响;D 1DHFR 2F56处理的鸡胚血管分布紊乱和具瘀血现象图2F56抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成 ×4DHFR 处理的鸡胚,其毛细血管排列有序;在经VEG F 处理的鸡胚尿囊膜,毛细血管数较其他组明显增多,呈现明显的促血管增生现象;但经DHFR 2F56处理的鸡胚尿囊膜,不仅其毛细血管数量减少,排列紊乱,迂曲变形,并且可见有局部出血现象,说明DHFR 2F56有抑制血管形成及破坏血管的作用,对后者的确机制尚不清楚。
