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酶法制备海洋活性肽及其功能活性研究进展张岩;吴燕燕;李来好;杨贤庆;宫晓静【摘要】海洋生物活性肤(Marine biological active peptide)是从海洋生物中提取的具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肤.酶法制备海洋生物活性肤是目前最常用的制备方法,是通过适当的蛋白酶水解海洋生物蛋白来制备生物活性肤的一种方法.海洋生物活性肤在降血压、抗氧化、抗凝血及抗菌等方面效果显著,对治疗和预防痰病具有巨大潜力.介绍海洋生物活性肤在酶解制备及其生物学功能方面国内外研究进展,为进一步开展海洋活性多肽研究提供参考.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)003【总页数】7页(P42-48)【关键词】海洋生物蛋白;酶法制备;生物活性肽;生物学功能【作者】张岩;吴燕燕;李来好;杨贤庆;宫晓静【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所国家水产品加工技术研发中心,广州510300;上海海洋大学,上海201306;中国水产科学研究院南海水产研究所国家水产品加工技术研发中心,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所国家水产品加工技术研发中心,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所国家水产品加工技术研发中心,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所国家水产品加工技术研发中心,广州510300;上海海洋大学,上海201306【正文语种】中文海洋生物资源丰富、种类繁多、生物链健全及再生能力强，海洋生物约占全球生物总量的一半。
多变的生活环境、漫长的进化历程使这些生物具有与陆生生物不同的生理性状，并产生许多结构新颖、作用特殊的生物活性物质，是新型生物活性物质的巨大来源，具有很大的开发潜力。
生物活性肽（biological active peptide）是指具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肽。
一般由蛋白质酶解制得，通常含有3-20个氨基酸残基，它在原蛋白质序列上没有生物活性，但是通过酸、碱或酶水解释放后具有生物活性，其活性取决于它们的氨基酸组成及其排列顺序[1]。
可控酶解从海洋鱼蛋白中制备生物活性肽的研究一、本文概述本研究工作聚焦于海洋资源的深度开发利用，特别是针对海洋鱼类蛋白这一丰富且未充分利用的生物资源，采用先进的可控酶解技术来制备具有生物活性的肽类物质。
论文首先阐述了海洋鱼蛋白作为生物活性肽潜在来源的重要性，以及酶解技术在蛋白质改性和功能成分释放方面的优势。
通过对沙丁鱼蛋白进行系统研究，我们探索了酶种类选择、酶解条件（包括pH值、温度、水解时间、酶底物比等）的优化，并结合超滤和离子交换层析等分离纯化手段，旨在高效地从鱼蛋白中获得具有特定生物活性的小分子肽。
研究的核心目标是探究如何通过精准调控酶解过程，实现对生物活性肽产量和结构的控制，进而鉴定其结构特征和生物活性。
实验不仅涵盖了活性肽的制备流程优化，还包括对其抗疲劳活性的深入研究，以验证所得到的生物活性肽在改善机体机能方面可能的应用价值。
最终，本研究期望为海洋鱼蛋白资源的高值化利用提供理论依据和技术支撑，推动生物活性肽在医药、食品、化妆品等领域的发展与应用。
二、海洋鱼蛋白原料及预处理方法海洋鱼蛋白作为生物活性肽的理想来源，因其丰富的氨基酸组成和潜在的生物活性而备受关注。
本研究选取了新鲜且富含高质量蛋白质的海洋鱼类，如沙丁鱼、鲐鲅鱼等，确保原料的新鲜度和无污染状态是保证最终产品品质的关键。
在预处理阶段，首先对捕捞或收购的鱼类进行了严格筛选，剔除了病害、死亡以及不新鲜的个体。
原料鱼经清洗去除内脏和杂质后，采用低温冷冻技术迅速锁住蛋白质结构和营养成分，防止腐败变质。
随后进行解冻，并对鱼肉进行机械破碎，通过物理方式去除脂肪和其他非蛋白成分，这一过程通常包括离心分离、压榨脱脂等步骤，力求将鱼蛋白的脱脂残留量控制在较低水平，以利于后续酶解反应的高效进行。
接着，对脱脂后的鱼肉进行温和热处理，以破坏肌肉组织结构并灭活可能影响酶解效果的天然酶类。
将处理过的鱼肉进一步研磨成细粉，以增大鱼蛋白与酶接触的表面积，提高酶解效率。
双酶法酶解大豆蛋白制备大豆低分子肽的研究
张红梅;陶敏慧;刘旭;李海燕
【期刊名称】《中国油脂》
【年(卷),期】2008(033)003
【摘要】以水解度为考察指标,研究了枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶制备大豆肽的工艺参数.结果表明,利用AS1.398中性蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解大豆蛋白制取低分子肽的方法是可行的,木瓜蛋白酶与AS1.398蛋白酶酶活力之比为1:1情况下水解效果较佳.双酶水解的最佳条件是底物浓度100 g/L,温度40 ℃,加酶量为12 500 U/g,pH为7.5.在此条件下,研究了水解时间与低分子肽得率的关系,表明水解4.5 h即可.
【总页数】3页(P23-25)
【作者】张红梅;陶敏慧;刘旭;李海燕
【作者单位】辽宁工程技术大学,理学院,辽宁,阜新,123000;辽宁工程技术大学,理学院,辽宁,阜新,123000;辽宁工程技术大学,理学院,辽宁,阜新,123000;辽宁工程技术大学,理学院,辽宁,阜新,123000
【正文语种】中文
【中图分类】TS229;TQ936.2
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双酶分步水解低值鱼蛋白的研究作者：周燕芳来源：《湖北农业科学》2014年第16期摘要：选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶两种酶对低值鱼蛋白进行分步水解，分析各因素对鱼蛋白水解的影响，以水解度为特征性指标。
单因素试验结果表明，先添加中性蛋白酶的水解效果优于先添加木瓜蛋白酶。
通过 L9（34）正交试验确定水解的最佳条件为水解时间为6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶量比（g∶g）为3∶1，水解温度为55 ℃，料液比（m/V，g∶mL）为1∶10，水解效果是最好的，在此条件下水解度为35.85%。
关键词：低值鱼蛋白；分步水解；中性蛋白酶；木瓜蛋白酶；水解度中图分类号：S661.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3890-03Abstract： The neutral protease and the papain were used to hydrolyze the low-price fish protein and study the process condition of enzymatic hydrolysis. The effects of dosage of enzyme，concentration of substrate， temperature of enzymatic hydrolysis， pH value etc were analyzed. The results showed that it was better to add neutral protease at first than to add the papain at first. The optimal conditions were the ratio of the neutral protease and the papain of 5∶1， the time of hydrolysis of 6 h， the concentration of substrate（m/V） of 1∶10， the temperature of enzymolysis of 55 ℃， pH 7.0. Under which， the hydrolysis could be 35.85%.Key words： the low-price fish protein； step by step hydrolysis； neutral protease； papain；degree of hydrolysis中国海域辽阔，其面积为陆地面积的1/3，是一个海洋大国。
![一种海洋低值鱼蛋白肽粉的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/aa58a29901f69e3142329442.png)
专利名称：一种海洋低值鱼蛋白肽粉的制备方法专利类型：发明专利
发明人：吴云通,黄贞胜,欧婧
申请号：CN201811635985.X
申请日：20181229
公开号：CN109793094A
公开日：
20190524
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种海洋低值鱼蛋白肽粉的制备方法，涉及水产品处理技术领域，包括以下步骤：（1）将低值鱼清洗去鳞后将鱼肉粉碎，加入蔗糖水溶液混合，得到鱼肉泥浆；（2）调节pH鱼肉泥浆值为7‑7.5，将鱼肉泥浆加热至40℃，加入酵母粉混合均匀；（3）加入800‑1400U/g木瓜蛋白酶、2000‑2400U/g碱性蛋白酶、600‑900U/g中性蛋白酶，在41‑43℃下保温2.5‑3.5h后加入500‑600U/g风味蛋白酶，再继续保温2‑3h；（4）将发酵后的鱼肉泥浆在120℃保温25‑35min，进行灭酶；（5）将灭酶后的鱼肉泥浆进行均质化以后进行造粒，得到低值鱼蛋白肽粉。
本发明制备的海洋低值鱼蛋白肽粉无腥味、无苦味，能够提高养殖产品的摄取量。
氨基酸含量高，能够利于鱼类的吸收促进生长，内切酶、外切酶同时作用，生产周期短。
申请人：福建大昌生物科技实业有限公司
地址：350000 福建省福州市福州经济技术开发区建设路12号(自贸试验区内)
国籍：CN
代理机构：杭州千克知识产权代理有限公司
代理人：裴金华
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双酶分步水解低值海洋鱼粉制备低聚肽的研究丁树慧1，2，王立梅2，齐斌2，张晶1，*（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）摘要：为了得到更多的低聚肽，分析比较碱性蛋白酶、中性蛋白酶等多种蛋白酶对低值海洋鱼粉的酶解效果，以水解度为指标，筛选出中性蛋白酶和碱性蛋白酶为最佳水解酶，并通过响应曲面分析法优化酶解工艺。
结果表明：最优酶解条件为：碱性蛋白酶与中性蛋白酶酶活力配比为6∶4先后加入，总加酶量为2500U/g ，pH 值为8时碱性蛋白酶酶解2h ，pH 值降为7时中性蛋白酶酶解3h ，酶解温度为50℃，该条件下水解度高达41.84%。
关键词：低值海洋鱼粉；蛋白酶；双酶酶解；响应面分析The Study of Oligopeptides from Low-value Marine Fish Meal with Double Enzyme Hydrolysis DING Shu-hui 1，2，WANG Li-mei 2，QI Bin 2，ZHANG Jing 1，*（1.College of Chinese Medicinal Materials ，Jilin Agricultural University ，Changchun 130118，Jilin ，China ；2.School of Biotechnology and Food Engineering ，Changshu Institute of Technology ，Changshu 215500，Jiangsu ，China ）Abstract ：In order to get more oligopeptides ，establish low-value marine fish meal hydrolysis conditions ，de -gree of hydrolysis as the indexes to compare the effect of hydrolysis of alkaline protease ，neutral protease and so on the many kinds of protease.Alkaline protease and neutral protease was selected as the best protease.The hy -drolysis conditions was optimized by response surface methodology.The results showed the optimal enzymatic hydrolysis conditions ：the alkaline protease and neutral protease enzyme activity ratio of 6∶4successively joined ，enzyme amount was 2500U/g ，the alkaline protease kept hydrolyzing for 2h when the pH was 8.Until the pH value dropped to 7.0，the neutral protease was added and continued stirring for another 3h ，enzymolysistemperature 50℃.Under the condition of the hydrolysis degree as high as 41.84%.Key words ：marine low-value fish meal ；protease ；double enzyme hydrolysis ；response surface methodology食品研究与开发F ood Research And Development圆园17年12月第38卷第24期DOI ：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.009基金项目：国家高技术研究发展计划项目（863计划）（2013AA102203-03）；江苏省科技厅重点研发计划（BE2017316）；江苏省科技厅重点研发计划（BE2017326）作者简介：丁树慧（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。
*通信作者：张晶（1971—），女（汉），教授，博士，研究方向：中药化学。
全球约有一半生物来自于海洋，其也是功能成分多样性生物的丰富来源[1]。
过去几十年来，许多传统鱼种存储量大幅度减少，海洋物种过度开发的比例增加，造成了世界海洋渔业严重恶化的状态[2-3]。
此外，人口的增长和对健康海洋食品消费意识的提高，增加了对鱼类和鱼副产物的需求，但许多几乎没有商业利益的非目标物种仍未得到充分利用[4]，一般加工成鱼粉，用于饲料、肥料等低附加值的产品[5-6]。
如何开发这些量大质低的鱼类，提高低值鱼粉的营养价值和生物活性[7-8]，对于我国经济和社会发展有着重要意义。
随着酶技术的发展，酶法水解在水产加工利用中的应用越来越广泛[9-10]。
不仅可以提高未充分利用鱼类资源的利用率[11]，而且能够释放肽类改善生物活性[12-15]。
单酶水解是以往研究最常用的方法，但水解效果通常不太理想，蛋白质很难被彻底水解，水解率较低，生产效益低下[16-17]，双酶酶解则因其良好的水解效果而得到人们的广泛关注[18-20]。
低值海洋鱼粉的蛋白质含量占50%~70%，消化率高达90%，氨基酸平衡，富含维生素B 和矿物质，水解液中含有较丰富的具有特殊生理活性的功能性肽。
目前，市场上的蛋白酶耐受盐浓度较低，在酶解含盐浓度较高的鱼粉时，水解度较低。
因此，开发海洋低值鱼粉低聚肽，蛋白酶的选择重中之重。
本试验利用低值海洋鱼粉进行酶催化反应，筛选出最佳蛋白酶，通研发与工艺42表1低值海洋鱼粉的酶解参数Table 1Parameters for enzymatic hydrolysis of low-value marinefish meal过响应面分析法优化酶解工艺条件，获得较多的低聚肽，提高资源利用率和经济价值，丰富低值海洋鱼粉的功能食品开发和利用。
1材料与方法1.1材料脱脂海洋鱼粉：中海海洋科技有限公司（青岛，中国）。
碱性蛋白酶（Alcalase ，2×105U/g ）、中性蛋白酶（Neutral ，8×105U/g ）、复合蛋白酶（Protamex ，1.07×105U/g ）、风味蛋白酶（Flavourzyme ，2.85×105U/g ）：诺维信生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（Papain ，8×105U/g ）、胰蛋白酶（Trypsin ，2.5×106U/g ）：上海西宝生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯：上海国药集团。
1.2仪器与设备酸度计（EL-20K ）：上海梅特勒仪器厂；定氮仪（KND-2C ）：上海纤检仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：常州国华电器；高速冷冻离心机（CR22G-Ⅱ）：日本日立公司；磁力加热搅拌器（CL-2）：上海豫康科教有限公司；超低温冰箱（Heto ）：美国Thermo 电气公司；真空冷冻干燥机：德国CHRIST 公司；电子天平（FA604A ）：上海精天电子仪器厂。
1.3试验方法1.3.1脱脂鱼粉酶解工艺流程脱脂海洋鱼粉→加去离子水→加酶→调pH 值→恒温水解→100℃灭酶15min →冷却→10000r/min 离心15min →取上清液→冷冻干燥→多肽成品1.3.2最适蛋白酶的筛选称取适量鱼粉，按照料液比为1∶10（g/mL ）加入去离子水，在恒温水浴中不断搅拌，分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，加酶量都为2500U/g ，在各自最适酶解温度和pH 值下，酶解6h ，每隔1h 取水解液测定水解度，见表1所示。
1.3.3双酶酶解最佳条件的确定筛选出水解度较高的两种蛋白酶，将酶解条件统一为：总加酶量2500U/g ，料液比1∶10（g/mL ），在各自温度、pH 值下，酶解5h ，研究先后加入和同时加入不同加酶方式对酶解效果的影响。
1.3.4单因素的优化以蛋白质水解度为衡量指标，对影响酶解反应的主要因素如加酶量、pH 值、温度、酶解时间、酶活力配比进行研究，确定最佳酶解工艺。
1.3.5响应面优化试验综合考虑实际生产的需要，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken 试验，选取加酶量、酶解时间、pH 值和酶解温度4个因素，以水解度为响应值，进一步优化低值海洋鱼粉的酶解条件。
1.4肽分子量分布采用高效凝胶过滤色谱法测定[21]。
鱼粉酶解产物溶于去离子水中，离心，微孔过滤膜过滤后上TSK gel2000SWXL ，流动相为乙腈和水，流速0.5mL/min ，温度30℃，波长为220nm 。
以细胞色素C 、抑肤酶、杆菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸为标准品做相对分子质量校正曲线。
1.5数据分析本研究运用Design expert8.06软件进行中心点试验设计和方差分析，试验数均以x ±s 表示。
各组数据均数间用t 检验判断其差异显著性。
p <0.05为显著性差异，p <0.01为极显著性差异。
2结果与讨论2.1最适蛋白酶的筛选Aluko 等[22]指出生物活性肽的活性与其分子量大小、末端氨基酸的种类有关，且不同蛋白酶具有不同的酶切位点和反应条件[23]，决定了水解肽键的数量和位置，使酶解产物有着不同的生理活性，因此酶的选择尤为重要，其决定了产物的组成、风味、功能等性质。
在本试验中，以低值海洋鱼粉为底物，选择碱性、中性、复合、风味蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶为水解反应催化剂，在酶各自最适温度、pH 值下进行酶解，6h 后试验结果如图1。
由图1可知，水解度随时间而增加，5h 后渐渐趋于平缓。
其中，碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解度相差不太大，但都高于其他4种蛋白酶。
由于蛋白酶具有专一性[24]，单酶水解时，只能从几个固定的氨基酸残基处进行水解，水解程度会受到一定程度的限制，水解产生的肽片段的末端氨基酸也较为单一。
为得到分子蛋白酶pH 值温度/°C 时间/h 料液比/（g/mL ）加酶量/（U/g ）碱性蛋白酶95561∶102500中性蛋白酶75061∶102500复合蛋白酶74561∶102500风味蛋白酶75061∶102500胰蛋白酶84561∶102500木瓜蛋白酶76061∶102500丁树慧，等：双酶分步水解低值海洋鱼粉制备低聚肽的研究研发与工艺43量更小和活性更好的水解产物，选用碱性蛋白酶和中性蛋白酶两种酶。
