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一株产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
一株产核酸酿酒酵母工程菌是指经过基因工程技术改造的酿酒酵母菌株，具有高产核酸能力的微生物。
以下是一种构建该菌株的方法和应用：
构建方法：
1. 选择合适的酿酒酵母菌株作为基础菌株。
2. 通过PCR或其他基因克隆技术，获得目标基因（例如核酸
合成酶基因）的DNA序列。
3. 将目标基因与适当的表达载体连接。
4. 将表达载体转化到酿酒酵母菌细胞中。
5. 通过筛选、鉴定等方法，获得具有目标基因表达的酿酒酵母菌株。
应用：
1. 高产核酸酿酒酵母工程菌可用于生产核酸药物，如核酸疫苗、抗肿瘤药物等。
2. 该菌株还可用于生物反应器中进行大规模生产核酸。
3. 可通过进一步改造该菌株，使其具备其他有益特性，如耐高温、耐久性等，进一步拓展其应用领域。
4. 该菌株也可用于基础科学研究，探索核酸生物学、基因调控等领域。
鼠疫耶尔森菌简介鼠疫耶尔森菌俗称鼠疫杆菌，是烈性传染病鼠疫的病原菌。
鼠疫是自然疫源性传染病，通过直接接触染疫动物或节肢动物叮咬而感染。
临床常见腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫。
1.生物学特征（1）形态与染色：鼠疫耶尔森菌为革兰阴性杆菌，形态短而粗，两端钝圆，两极浓染，大小为（1.0～2.0）μm×（0.5～0.7）μm.有荚膜，无鞭毛，无芽孢。
陈旧培养物或3%氯化钠琼脂培养基上呈明显多形性。
（2）培养：需氧和兼性厌氧，在普通培养基上即可生长。
最适生长温度是28℃～30℃。
培养基最适pH为6.9～7.1.培养16～18h，用显微镜观察可见一层形状不一，浅灰色小菌落，这是鼠疫耶尔森菌培养初期的菌落特征，这对本菌的鉴定有一定意义。
在培养24～48h后可形成直径0.1～0.2mm，圆形。
中心突出，透明的浅灰色小菌落。
72h后菌落直径可达4mm.在液体培养基中生长良好，开始浑浊生长，24h后为沉淀生长，48h后形成菌膜，稍加震动菌膜呈钟乳石状下垂。
（3）生化反应：不活跃，在双糖铁培养基上可分解葡萄糖，少数菌株可分解乳糖，不产生硫化氢，MIU培养基无动力，不产生靛基质，尿素酶试验阴性。
2.微生物学检验（1）标本采集：主要采集血液、痰和淋巴结穿刺液。
（2）检验方法及鉴定：鼠疫耶尔森菌为甲类病原菌，传染性极强，故应严格遵守检验操作规程，要求实验室有隔离设施，防鼠、防蚤和严密的个人防护措施；用过的实验器材及物品随时消毒处理。
1）直接涂片检查：一般制片两张，分别用于革兰染色和美蓝染色，可见革兰阴性球杆菌，形似芝麻，两端浓染。
2）分离培养：鼠疫耶尔森菌学检验中分离培养步骤十分重要，分离培养时未污染标本可直接接种血平板，污染标本则需接种选择性培养基，如龙胆紫亚硫酸钠琼脂。
经28℃～30℃培养24～48h后，挑选菌落作鉴定。
3）鉴定：根据菌落特征，细菌形态和肉汤中呈“钟乳石”状发育，KIA结果利用葡萄糖，不利用乳糖，不产H2S，MIU均为阴性反应。
・论著・文章编号:1007-8738(2005)04-0425-04鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在酿酒酵母中的表达及鉴定刘 斌1,2,郑文岭13,邓 海1,马文丽3(1广州军区广州总医院肿瘤分子生物学研究所,广东广州510010;2井冈山师范学院,江西吉安343009;3第一军医大学分子生物学研究所,广东广州510515)收稿日期:2004-06-28; 修回日期:2004-11-02基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .39880044)作者简介:刘 斌(1971-),男,江西吉安人,工程师,硕士生.Tel:(0796)8106232;E mail:g oldendays 20022002@yahoo .co m .cn3Corres ponding author,Email:wenling@fi m mu .edu .cnExpressi on and i den ti f i ca ti on of F1an 2ti gen of Y .pestis i n Saccharom yces cere 2v isi a eL I U B in 1,2,ZHEN G W en 2ling 13,D EN G Hai 1,MAW en 2li31I nstitute of Tu morMolecular B i ol ogy,General Hos p ital of Guang 2zhou Command,Guangzhou 510010;2J inggangshan TeachersTraining College,J i ’an 343009;3I nstitute of Molecular B i ol ogy,FirstM ilitary Medical University,Guangzhou 510515,China [Abstract] A IM :To co n struc t the re com b i na n t vec t o r co n ta i n i ng F1gene caf1o f Y .p e s tis a nd exp re ss it i n S ac 2cha r om yce s ce revis i ae.M ETHOD S:F1ge ne caf1o f Y .p e s tis w a s i n se rted i n t o pHSS62m Tn 23xHA /l a cZ p l a sm i d t o co n struc t re com b i na n t vec t o r pHSS62m Tn 23xHA /l acZ 2caf1.The recom b i nan t p l a sm i d w a s li nea ri zed w ith No t I a nd then tran sfo r m e d i n t o yea s t ce lls by a ce ta te lith i um (L i A c )m e th 2o d.Po s iti ve re com b i na n ts w e re se l ec te d w ith u ra c il 2l a ckm e d i um.The exp re s sed F1an ti gen w a s i den ti fi e d by SD S 2PAGE and W e s te rn b l o t .RESUL TS:SD S 2PAGE a nd W e st 2e rn b l o t a na l ysis show e d tha t F1a n ti ge n w a s e xp re sse d i n S accha r om yce s ce re visi a e.CO NCL US I O N:The re com b i 2nan t vec t o r pHSS62m Tn 23xHA /l a cZ 2ca f1ha s be en co n s truc 2ted and e xp re s sed succe s sfu ll y i n Sa ccha r om yce s ce re visi 2a e.The se re su lts l a y the fo unda ti o n f o r p rep a ri ng ge ne vac 2c i ne o f Y .p e s tis w h i ch co u l d be ta ken vi a a li m en ta ry tra c t p a thw a y .[Keywords] Y .p e stis;F1a n ti gen;Sa ccha r om yce s ce re 2vis i ae;e xp re s s i o n[摘要] 目的:构建含鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf 1的重组载体,并在酿酒酵母中表达。
方法:将鼠疫杆菌的F1抗原结构基因caf 1插入到pHSS62mTn 23xHA /lacZ 质粒中,构建重组载体pHSS62mTn 23xHA /lacZ 2caf 1。
将重组载体经N ot I 酶切后,以醋酸锂法转化酿酒酵母,将转化的酿酒酵母接种于SC 2U ra 平板上筛选阳性克隆,表达产物用S DS 2P AGE 和W estern bl ot 进行鉴定。
结果:经S DS 2P AGE 鉴定和W estern bl ot 分析表明,转化的酿酒酵母可表达鼠疫杆菌F1表面抗原蛋白。
结论:成功地构建了重组载体pHSS62mTn 23xHA /lacZ 2caf 1,并在酿酒酵母中稳定表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为制备可经消化道途径免疫的鼠疫杆菌基因疫苗奠定了基础。
[关键词] 鼠疫杆菌;F1抗原;酿酒酵母;表达[中图分类号] R378.6+1 [文献标识码] A 鼠疫(Plague )是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pes 2tis )引起的自然疫源性烈性传染病。
因全世界有各种类型的动物自然疫源地,难于在短期内彻底消除,故研制针对鼠疫杆菌的疫苗意义重大。
由于传统疫苗存在安全隐患,且具有效率低下、接种反应率高、不能保护人体免受肺鼠疫侵害等缺陷,因此,研制新型的基因工程疫苗很有必要。
酿酒酵母被认为是基因治疗药物和免疫物质的天然携带载体,而且具有安全、方便、成本低廉等优点[1]。
在本实验中,我们构建了含有鼠疫杆菌F1抗原结构基因的重组酵母,并成功地表达了鼠疫杆菌的F1表面抗原,为进一步利用此重组酵母,研制可经消化道途径给予的鼠疫杆菌的基因疫苗奠定了基础。
1 材料和方法1.1 材料 从云南鼠疫杆菌株质粒1351/482E V 中扩增的caf 操纵子基因片段,由第一军医大学马文丽教授惠赠。
pHSS62mTn 23xHA /lacZ 质粒,由美国耶鲁大学基因分析中心的Snyder M 教授惠赠。
大肠杆菌DH5α和酿酒酵母I N VSc1由本室保存。
所需限制性内切酶N ot I 、Sac I 、Sbf I 以及T4DNA 连接酶,均购自大连宝生物公司。
鼠疫杆菌诊断血清,购自吉林省地方病第一防治研究所。
HRP 2羊抗兔I gG 购自华美生物公司。
其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 引物的设计 根据已发表的鼠疫杆菌caf操纵子基因的序列,采用Pri m er Pre m ier5.0软件,设计并合成以下引物,P1:5′2G AG G AGCTC GTTCGTG2 G ATTGG ATT A23′(下划线处为Sac I的酶切位点), P2:5′2TCACCTGCAGG TT AGGCT CAAAG T AG23′(下划线处为Sbf I的酶切位点),用以扩增F1抗原结构基因caf1的序列。
1.2.2 caf1基因的扩增 以caf操纵子基因片段为模板,以P1、P2为引物,进行PCR扩增反应。
在50μL反应体系中,加入5μL10×PCR buffer、2μL 25mmol/L MgCl2、2μL10mmol/L d NTP、2μL caf 操纵子基因片段、1μL5U Taq酶及上、下游引物各100pmol/L。
扩增条件为:94℃预变性5m in、94℃变性30s,54℃退火30s,再于72℃延伸3m in,共进行30个循环,再于72℃延伸7m in。
取5μL PCR 扩增产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 重组质粒的构建 采用DNA凝胶回收试剂盒,回收50μL反应体系中的PCR扩增产物。
将回收的PCR产物经Sac I和Sbf I双酶切及纯化后,与经同样的酶双酶切并按琼脂糖凝胶电泳方法回收的7kb片段,用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α,在LB平板(含Kan)上筛选阳性克隆。
各步骤均按《分子克隆实验指南》[2]中的标准方法进行。
利用PCR、酶切、测序对阳性重组质粒进行鉴定。
1.2.4 酿酒酵母的同源重组[3] 以转化缓冲液(0.2 mol/L L i A C、400g/L PEG4000及100μmol/Lβ2ME)处理酿酒酵母后,将构建的重组质粒用N ot I酶切线性化,以不同的浓度转化酵母,在营养缺陷型SC2U ra 平板上铺板,于30℃培养4d左右,能在平板上长出白色菌落者,即为同源重组的阳性重组子。
1.2.5 阳性重组子的菌落PCR鉴定 酵母细胞经蜗牛酶(20g/L)溶液破壁处理后,可生成原生质体,将其在液氮冻融3次后,细胞破裂释放出基因组DNA。
以此为模板,采用设计的引物进行PCR。
PCR 产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,操作步骤均按《酵母遗传学方法实验指南》[4]中的标准方法进行。
1.2.6 表达产物的S DS2P AGE和W estern bl ot分析 将重组酵母的培养上清浓缩[5]后,对浓缩液进行S DS2P AGE和W estern bl ot鉴定。
W estern bl ot分析中,以鼠疫杆菌的诊断血清为一抗,以HRP标记的羊抗兔I gG为二抗,用DAB显色后观察结果。
2 结果2.1 caf1基因的扩增及鉴定 将caf操纵子基因片段的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后,出现大小约642bp的DNA条带(图1),同目的基因caf1片段的大小基本一致。
说明采用所设计的引物及优化后的反应参数,可扩增目的基因caf1片段。
由于电泳结果中没有明显的非特异性扩增带,因而无需对目的片段进行凝胶回收。
图1 以caf操纵子基因为模板对caf1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig1 Analysis of PCR p r oduct of caf1gene using caf oper on gene as te mp late by agar ose gel electr ophoresis1:Purified PCR p r oduct;2:Unpurified PCR p r oduct;M:DNA marker.2.2 重组质粒的构建 将筛选的阳性克隆培养后提取重组质粒,并以P1、P2为引物进行PCR扩增,再将提取的重组质粒及其PCR产物与原酵母质粒pHSS62mTn23xHA/lacZ和caf1基因的PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳。
