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产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定一实验目的及要求：为了从自然界获得产淀粉酶活力较高的菌株,从面粉、储存面仓、发霉玉米等样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌，并对产淀粉酶菌的生理生化进行了探讨。
从面粉中得到的产淀粉酶菌共有三种，颜色有红色和白色。
从其菌体形态初步了解其特征，随后用唯一碳源实验、葡萄糖酵解实验、过氧化氢酶实验等分析并鉴定其生理生化特性。
二名词定义：淀粉酶分离鉴定淀粉酶 amylase，AMY,AMS一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。
根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
微生物的酶几乎都是分泌性的。
此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。
因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。
另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。
一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。
β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。
作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。
南昌大学实验报告淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定一、实验目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。
二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括a—淀粉酶和B -淀粉酶等，a -淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的a -1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。
这种淀粉- 碘复合物在660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定a -淀粉酶的活力。
三、实验器材及试剂：1、培养基：（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCI5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121C灭菌15min，待冷却至50C左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g, 硝酸钾1g, 磷酸氢二钾, 氯化钠, 硫酸镁, 硫酸亚铁, 琼脂20g, 水1000毫升，调整pH值到〜。
）（3）摇瓶培养：淀粉培养液。
2、试剂：碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L 乙酸、%生理盐水。
3、器材：培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
51BIOTECHWORLD 生物技术世界酸性α-淀粉酶属于处于酸性环境可以分解淀粉的种类,能够利用到酸性环境下淀粉类的生产,就像麦芽糖浆的产出[1]及烧酒的酿造[2]。
研发符合胃酸性条件(pH大概为2.0)的酸性α-淀粉酶来生产消化助剂进而使临床成效更明显[3],另外酸性α-淀粉酶还能够使用到青贮饲料、发酵液体、无用液体的解决等各个方面。
现在从酿制酒曲等酸性物质中分离得到的真菌类微生物,它代谢产物α-淀粉酶大多具有较好的耐酸特征(最适pH 4.0至5.0),可是,此类微生物主要是固态培养,需要的时间较长;还有,部分真菌菌株培育当中也许会产生毒素,属非安全生产菌株。
这些年来,有关专家在制备淀粉酶细菌类菌株的选择经过中经历了许多探究,芽孢杆菌属是较为重视的一种菌体。
虽然已分离得到具备各种应用特性的α-淀粉酶类,它们多数具有较好的耐热性,但具有较好耐酸特性的菌株却相对较少,主要是因为芽孢杆菌属这类菌株自身具有较好的耐热特性,但大多生活在偏中性自然环境中。
倘若可以挑选到指定的细菌菌株,也许会获取拥有优质特性的淀粉酶类,为解决产业界一直存在的酶制剂运用弊端提供特别好的研究资料。
1 材料与方法1.1 培养基初筛培养基:可溶性淀粉1%,硫酸铵0.25%,硫酸镁0.02%,KH2PO4 0.3%,硫酸亚铁0.0025%,氯化钙0.025%,琼脂2%,pH4.5。
LB液体培养基:蛋白胨10g,酵母5g,NaCl 5g,10M NaOH调pH值至7.0,加ddH2O至1000ml,121℃灭菌15min。
1.2 菌种筛选培养称取1 g样品,加入100 mL无菌水中,振荡30 min后静置,配置梯度溶液,分别取200μL加入筛选培养平板上均匀涂布,37℃倒置培养 24 h,长出菌落后滴加稀碘液,挑取有明显透明圈菌落。
划线到LB培养基上进行分离培养,在37℃倒置培养24h。
1.3 摇瓶液体发酵培养将划线分离得到的菌种分别接种到液体培养基中,37℃,摇床培养48h。
实验二：淀粉酶菌株的诱变与筛选指导老师：生命科学学院生物技术摘要：实验目的：了解诱变育种的基本原理以及用诱变育种筛选高产菌种的基本方法。
采用方法：利用紫外线诱变育种，分别对要诱变的菌株进行不同时间的诱变，将在红光的照射下将结果稀释不同倍数，涂到平板上进行暗室培养，48小时后观察，用碘液测酶活力，并计算致死率。
关键词：红光；暗室；紫外线；酶活力；诱变；致死率自然界中分离出的菌株为野生菌株，一般发酵活力很低，所以要经过人工选育等来得到突变株。
突变分为自发突变和诱导突变。
因自发突变的频率较低，所以采用诱导突变。
所谓的诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使突变率大幅度提高。
然后筛选出目的突变菌株，以供生产实践或科学实验用。
诱变可由化学或物理因素引起，紫外线诱变是最简单、最常用的一种。
紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
1.材料和方法1.1材料1.1.1实验菌株枯草杆菌1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、20w紫外线、超净工作台、培养皿、胶头滴管等实验仪器。
1.2方法1.2.1培养基的配置淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
本实验旨在筛选具有淀粉酶活性的菌株，经过活性药物筛选法，通
过对新鲜海藻类源淀粉酶活性药敏试验结果，用神经酰胺蓝显色法共
分离出了12株具有淀粉酶生成活性的菌株，且12株菌株的淀粉酶活
性均明显优于对照组的淀粉酶活性。
经过16s rDNA分析，结果表明，
这12株菌株属于嗜热及高温嗜热乳杆菌科，包括拟南芥病毒乳杆菌属、干燥乳杆菌属，伯氏乳杆菌属、钝吸乳杆菌属等。
以上结果表明，该
方法高效可靠，可以用于筛选具有淀粉酶活性的微生物菌株，为药物
的开发和应用提供了重要的理论支持。
产胞外淀粉酶的菌株的筛选以及酶活力的测定一：实验原理异养型微生物在生存的时候，自己不能产生可以供机体使用的能源物质。
所以必须从体外获取这些能源物质。
某些异养型的微生物可以利用淀粉作为能源物质将其分解为葡萄糖让自己利用。
但是淀粉作为大分子的物质不能直接进入微生物的体内直接将其分解。
所以某些微生物会产生胞外淀粉酶，将自己周围的淀粉分解为葡萄糖。
再葡萄糖进行吸收利用。
本实验就是筛选出一种产胞外淀粉酶的高效菌株，并对其产生的胞外淀粉酶的酶活力进行初步检测。
二：实验器材，试剂1样品：发霉的面包，富含淀粉的土壤，2仪器：离心机，试管，紫外分光光度计，三角瓶，摇床，分析天平，定量移液器，药匙，培养皿，恒温水浴锅，恒温培养箱，超净工作台，接种环，接种针，酒精灯，高压灭菌锅，直尺，移液管，洗耳球。
3试剂：碘固体，DNS（3，5－二硝基水扬酸），1mg/ml的麦芽糖溶液，1%的淀粉标准溶液，PH为5.5的柠檬酸缓冲液。
4培养基：淀粉培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，PH7.0。
种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0。
产酶培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。
三：实验步骤1：初筛①若样品为富含淀粉的土壤，则称取土壤样品10g放在盛有90ml无菌水和8颗小玻璃珠的三角瓶中，放置在摇床上震荡30min后再进行七次梯度稀释，分别取第4,5,6,7次梯度稀释后的稀释液各1ml进行初步培养。
所用的培养基为淀粉培养基。
在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
②若样品为发霉的面包，则用接种环或接种针挑取部分的霉块。
将挑取的霉块浸泡在装有10ml无菌水的试管里震荡1min进行稀释。
取1ml稀释液进行初步培养。
所用培养基为淀粉培养基。
在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化摘要：淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株，再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化，实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词：淀粉酶；别离筛选；紫外线诱变；优化；提纯1、引言淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。
我国是传统的农业大国，开展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的根底都是以淀粉质原料的水解作为第一步，因此淀粉质原料的液化情况直接关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
所以，改良淀粉液化工艺也是降低生产本钱，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
显然，改良淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们知道，现在淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中别离出产淀粉酶的枯草杆菌，通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株，并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以到达加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的根本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法2. 1 实验材料2．1．1 样品：贵师大综合楼附近的土壤2．1．2 培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨〔斜面〕、牛肉膏蛋白胨〔液体〕种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液2．1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
