下载文档原格式
抗人 CD3 单克隆抗体(Clone:OKT3)
背景 CD3 是由四条不同的链组成的蛋白质复合物。
在 哺
乳动物中，该复合物包含一条 CD3γ链，一条 CD3δ链和
两 条 CD3ε链。
这些链和T细胞受体（TCR）以及ζ链在T
淋巴细胞中产生一个活化信号。
CD3 抗体识别所有 T 细
胞，也就是说，它可以和70-80％的人外周血淋巴细胞以及
65-85％的胸腺细胞发生反应。
该抗体识别的抗原的表位位
于 CD3 复合体的ε链。
该 OKT3 抗体可用于激活和扩增
T 细胞。
应用 体外 T 细胞的激活和扩增。
成份 溶解在 PBS 中，经 0.2μm 过滤制成的冻干粉。
内毒素水平 鲎试验方法检测。
内毒素水平＜0.1EU/μg。
制剂 使用灭菌的ddH2O制备。
如果用0.5ml ddH2O溶解，
则抗体浓度为 1mg/ml。
贮存 -20℃~ -70℃贮存，避免反复冻融。
克隆:OKT3
货号: HYMAB-H003
包装大小:500ug
贮存: -20℃~ -70℃
制剂: 无菌ddH2O
特征: 人 CD3
Ig 类别: 鼠 IgG2a，kapa
使用建议:在体外人 T 细胞
活 化 时 建 议 使 用 浓 度
10-100ng/ml。
图 1. OKT3 激活 T 细胞对 CD28 蛋白
的表达
图 2. 抗-hCD3 抗体在刺激人 T 细胞增值能力
的生物学活性（4 天）
研究人员使用时需要对使用浓度进行优化。
单克隆抗体的鉴定引言单克隆抗体是一类由单个免疫细胞分泌的抗体，具有高度特异性和亲和力。
它被广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其质量和效力的关键步骤之一。
本文将介绍单克隆抗体的鉴定方法和流程。
一、单克隆抗体的来源和制备单克隆抗体的制备通常分为两个阶段：免疫原注射和细胞融合。
免疫原注射是将特定抗原注射到动物体内，诱导免疫细胞产生特异性抗体。
细胞融合是将免疫细胞与肿瘤细胞融合，形成可无限增殖的杂交瘤细胞。
二、鉴定单克隆抗体的特异性特异性是评估单克隆抗体质量的重要指标。
常用的鉴定方法包括ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术。
其中，ELISA是最常用的方法之一，可以通过将抗原固定在微孔板上，然后加入单克隆抗体进行检测，来评估其特异性和亲和力。
三、鉴定单克隆抗体的亲和力亲和力是指抗体与抗原结合的强度。
常用的亲和力鉴定方法包括ELISA、流式细胞术和生物传感等技术。
其中，ELISA是最常用的方法之一，可以通过变化抗原的浓度或稀释单克隆抗体的方式来评估其亲和力。
四、鉴定单克隆抗体的稳定性稳定性是评估单克隆抗体质量的重要指标之一。
常用的稳定性鉴定方法包括温度稳定性、冻融稳定性和长期保存稳定性等。
其中，温度稳定性可以通过将单克隆抗体暴露在不同温度下，然后检测其活性的变化来评估。
五、鉴定单克隆抗体的纯度纯度是评估单克隆抗体质量的重要指标之一。
常用的纯度鉴定方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱和质谱等技术。
其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的方法之一，可以通过检测单克隆抗体与其他蛋白质的分离情况来评估其纯度。
六、鉴定单克隆抗体的交叉反应性交叉反应性是指单克隆抗体与非目标抗原结合的能力。
常用的交叉反应性鉴定方法包括ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术。
其中，ELISA是最常用的方法之一，可以通过将非目标抗原固定在微孔板上，然后加入单克隆抗体进行检测，来评估其交叉反应性。
七、鉴定单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用广泛，包括医学诊断、药物研发和治疗等领域。
深圳市达科为生物工程有限公司 地址：深圳市坪山区坑梓街道金辉路14号深圳市生物医药创新产业园区1号楼702、703 518122重组人源化CD3单抗说明书Recombinant anti-CD3 humanized antibodyCat#：6151011/6151012/6151013基本信息：名 称：重组人源化CD3单抗 克 隆 号：OKT3H特 异 性：TCR-CD3复合物ε链 反应种属：Human 同 型：Human IgG1 性能参数：内 毒 素：＜1EU/μg （LAL ） 纯 度：＞95% by SDS-PAGE配 制：0.22μm 过滤，溶于PBS 溶液中，pH 7.2，不含防腐剂 纯 化：通过亲和层析法纯化应用范围：FCM 、Elisa 、功能分析、T 细胞活化 产品描述：CD3/T 细胞受体(TCR)复合物，它由两个CD3ε，一个CD3γ，一个CD3δ，一个CD3δ(CD247)和T 细胞受体(α/β和γ/δ)异质二聚体组成。
CD3ε是CD3 / TCR 复合物的一条20 kD 链。
CD3在所有成熟的T 淋巴细胞，自然杀伤样T 淋巴细胞和部分胸腺细胞中表达。
CD3，也称为T3，是免疫球蛋白超家族中的一员，在抗原识别、信号转导和T 细胞活化过程中发挥重要作用。
重组人源化CD3抗体是达科为生物工程公司和美国团队合作开发的人源化CD3抗体。
该人源化抗体，保留鼠源抗体的CDR 区，其他序列完全人源化，人源化序列达到92%，即保持了鼠源抗体的高亲和力，又消除了鼠源抗体的免疫原性。
该人源化抗体序列经过优化，亲和力高，性质稳定，不易形成多聚体，在体外具有很好的活化T 细胞的功能。
产品采用基因工程表达，无血清培养基体系，在符合GMP 规范的车间生产。
该人源化抗体激活T 细胞不依赖于抗原，抗体Fab 段特异性识别TCR-CD3复合物的ε链，激活T 细胞活化信号通路，刺激T 细胞的增殖和活化。
深圳市达科为生物工程有限公司 地址：深圳市坪山区坑梓街道金辉路14号深圳市生物医药创新产业园区1号楼702、703 518122 Tel************** Fax************** E-mail:*************测试数据：SDS-PAGE 生物活性使用方法：活化T 细胞应用：直接将抗体加入PBMCs 或T 细胞悬液中，推荐抗体终浓度为50ng/ml ，可根据细胞活化状态选择抗体浓度为20ng-100ng/ml 。
单克隆抗体的鉴定引言：单克隆抗体是一种重要的生物医学研究工具，可用于疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其特异性、亲和性和稳定性的重要步骤，以保证其在实际应用中的准确性和可靠性。
本文将介绍单克隆抗体鉴定的基本原理、常用的鉴定方法和相关的实验步骤。
一、单克隆抗体鉴定的基本原理单克隆抗体鉴定的基本原理是通过筛选和鉴定细胞克隆，确定具有特定抗原识别能力的单个细胞克隆，然后将其扩增并纯化得到单克隆抗体。
鉴定的关键在于筛选出具有高特异性、高亲和力和稳定性的单克隆抗体。
二、单克隆抗体鉴定的常用方法1. 杂交瘤技术：杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体鉴定方法之一。
该技术通过将抗原刺激的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，然后通过限稀稀释法或酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
2. 胶体金法：胶体金法是一种快速、灵敏的单克隆抗体鉴定方法。
该方法利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合，形成可见的颜色反应，通过观察颜色变化来确定是否存在特定的抗原-抗体反应。
3. 免疫组化技术：免疫组化技术是一种广泛应用于单克隆抗体鉴定的方法。
该技术通过将细胞或组织样本与单克隆抗体反应，然后通过显色剂或荧光染料来观察特定抗原的表达情况，以判断单克隆抗体的特异性和亲和力。
三、单克隆抗体鉴定的实验步骤1. 抗原制备：首先需要制备纯化的抗原，可通过基因工程技术获得重组蛋白或通过提取生物体中的抗原蛋白。
2. 免疫动物免疫：将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 杂交瘤细胞融合：将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：通过限稀稀释法或ELISA等方法筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体扩增：将筛选出的单克隆抗体进行扩增，并经过多次培养和纯化，以获得足够的纯净抗体。
6. 单克隆抗体鉴定：通过免疫组化技术、胶体金法等方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性、亲和力和稳定性。
论著文章编号:1007-8738(2004)05-0552-04抗CD3scFv 基因的真核表达及其生物学活性鉴定杨章民,胡劲松,来宝长,王一理*,司履生(西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所,陕西西安710061)收稿日期:2004-01-14; 修回日期:2004-03-25基金项目:国家卫生部科学研究基金资助项目(No.98 1 232);陕西省自然科学基金资助项目(No.2002C118)作者简介:杨章民(1966-),男,陕西丹凤人,副教授,博士.Tel:(029)82655429;Email:yz hangmin@yahoo.c om* Corres ponding author,Tel:(029)82655499Eukaryotic expression of anti CD3single chain Fv antibody gene and the charac terization of its bioactivitiesY ANG Zhang min,HU Jin song ,LAI Bao chang,WANG Yi li *,SI L shengInstitute for Cancer Research,School of Life Science &T echnology,Xi an Jiaotong University,Xi an 710061,ChinaAbstractAIM:To express anti CD 3scF v in H ela cells and investigate its biological activity.METHODS:DN A fragment encoding anti CD 3scFv was ins erted into eukaryotic express ion vector pD is play .The recom binant expression vector was sequenced and then transfected into H ela cells by electroporation m ethod.The expression of anti CD 3s cFv was identified by in situ hybridiza tion.In vitro T lym phocyte activation was then detected by 3H TdR incoporation method.Anti CD 3scFv gene transfected Hela cells were co cultured w ith and T cells cytotoxicity was m ea sured by MTT colori m etry.RESULTS:Anti CD 3s cFv gene was correctly inserted into pDisplay and expressed in Hela cells.The secreted anti CD 3scFv was able to activate T lymphocy tes in the presence of anti CD 28m Ab.Cytotoxicity could be observed when anti CD 3scFv gene transfected Hela cell s were m ixed and co cultured with T lym phocytes .CONC LUSION:Anti CD 3scFv expressed by Hela cells can activate T lymphocytes.Keywords:anti CD 3single chain Fv antibody;eukaryotic expression;biological activity摘要目的:真核表达抗CD3单链抗体(scFv ),并研究其生物学活性。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710978345.8(22)申请日 2017.10.18(71)申请人 南京鼓楼医院地址 210008 江苏省南京市鼓楼区中山路321号(72)发明人 刘宝瑞 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司32252代理人 戴朝荣(51)Int.Cl.C07K 19/00(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C12N 15/70(2006.01)A61K 47/42(2017.01)A61K 39/395(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用(57)摘要本发明公开了一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用。
本发明将穿透肽iRGD成分作为实现肿瘤主动靶向性、高穿透性的分子，将CD3的单链抗体与其连接，形成一个可以活化T细胞并能有效靶向杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。
成功构建后经反复实验验证，本发明具有明确肿瘤靶向性和高穿透性，能够切实地增强免疫细胞的抗肿瘤治疗效果，应用于抗肿瘤药物中。
权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图4页CN 107739410 A 2018.02.27C N 107739410A1.一种CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由靶向人CD3单链抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽连接组成。
2.根据权利要求1所述的CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含但不限于CD3单链抗体、单域抗体、单克隆抗体以及能活化T细胞的CD3功能域或其他能活化T细胞的分子，肿瘤靶向穿透肽包含但不限于iRGD、iNGR，以及含前述靶向穿透肽结构的融合肽、融合蛋白或其它修饰成分。
3.根据权利要求1所述的CD3单链抗体-iRGD融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或与序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同源性在80%-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由（1）衍生的蛋白。
抗人CD19免疫毒素的研究现状
陈英虎;汤永民
【期刊名称】《国际输血及血液学杂志》
【年(卷),期】2002(025)005
【摘要】抗人CD19免疫毒素的动物和临床实验研究表明,在导向治疗B淋巴细胞恶性肿瘤已取得了较为理想的疗效.本文综述它们的药代动力学、毒性反应、免疫原性、与化疗药物或其他单抗及免疫毒素之间的协同作用,以及对B淋巴细胞恶性肿瘤的疗效.
【总页数】3页(P436-438)
【作者】陈英虎;汤永民
【作者单位】310003,杭州,浙江大学医学院附属儿童医院;310003,杭州,浙江大学医学院附属儿童医院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.双功能抗体抗CD3/抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用
2.抗CD3/抗
CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定3.二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达4.抗人肺腺癌单克隆抗体—天花粉蛋白免疫毒素对荷人肺…5.抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴
定
【关键词】单链抗体
【关键词】CD3分子；单链抗体
【Abstract】The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions (VH and VL) were cloned by RTPCR from OKT3 hybridoma cells, which produced antiCD3 moleclonal antibody. The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv (scFv). The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface. By three panning rounds, we have obtained two singlechain antibodys that specific for CD3. The antiCD3 scFv will be a reagent for diagnosis and therapy of immunodisorder
1 实验资料
杂交瘤细胞OKT3来自ATCC.质粒pCANTAB5E，大肠杆菌TG1和HB2151，内切酶SfiI和NotI, 可变区引物均购自Pharmacia公司.Taq DNA聚合酶，mRNA磁性分离试剂盒购自Promega公司.以分泌抗CD3单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞OKT3为原始材料，采用Promega公司试剂盒，从大约107细胞中分离和纯化mRNA，合成cDNA 第一链.通过RTPCR分别扩增出重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因. 为了加强抗体轻、重链可变区（Fv）的稳定性和更好地维持抗体分子内结合抗原区的空间构象，在VH和VL基因之间用一段编码(Gly4Ser)3的DNA序列把二者连接起来, 构成抗体可变区单链融合基
因.为了把单链抗体基因插入pCANTAB5E 质粒，我们以单链抗体基因为模板，引入一对含SfiI和NotI 酶切位点的引物，再次PCR 扩增.扩增产物Mr约720，基因大小与预测的单链抗体基因相符合（图1）.把单链抗体基因插入到表达载体pCANTAB5E所含的噬菌体外壳蛋白g3p基因中. 转化大肠杆菌TG1感受态细胞后，在辅助噬菌体M13K07的作用下，单链抗体和外壳蛋白g3p以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成一个抗CD3单链抗体文库.以外周血单核细胞为抗原，用ELISA方法鉴定噬菌体抗体的免疫活性.首先用细胞分离液分离外周血T细胞，然后包被在经多聚赖氨酸处理过的96孔酶联板上.分别与重组噬菌体抗体温育1 h,用PBS淋洗3次后，加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体温育1 h, 再用PBS淋洗3次，加入底物进行颜色反应.用酶标仪在490nm处检测每孔的吸收值.挑选阳性克隆，感染大肠杆菌，获得培养上清，再进行免疫活性鉴定.经过三轮亲合－感染－扩增的免疫筛选过程，使CD3重组噬菌体抗体得到富极. 随机挑选12个重组噬菌体抗体克隆进行ELISA检测.从中选出免疫活性最强的两株阳性克隆.把这两株阳性克隆的基因转入大肠杆菌HB2151，经IPTG 诱导培养后，可在上清中收集可容性单链抗体.ELISA进一步证明该抗体能够特异识别外周血单核细胞和淋巴母细胞性白血病细胞，而不结合黑色素瘤细胞和人宫颈癌细胞(图2).说明单链抗体保留了原单克隆抗体的抗原特异性.
1:1 kb标准分子量；2:抗体VL基因PCR扩增产物；3：重组质粒经XbaI和BamHI双酶切，鉴定VL基因；4：抗体VH基因PCR
扩增产物；5：重组质粒经XhoⅠ和HindⅡ双酶切，鉴定VH基因.
图1 琼脂糖凝胶分析PCR产物和重组载体酶切产物鉴定（略）
可溶性单链抗体结合外周血单核细胞（PBC）和淋巴母细胞性白血病细胞（MOLT4），但不结合黑色素瘤细胞（A375）和人宫颈癌细胞（Hela）.
图2 ELISA检测单链抗体免疫活性（略） 2 讨论
单链抗体被认为是具有抗原结合能力的最小功能单位［1］.它在某些应用方面比完整抗体具有更多的优越性，如免疫原性较小，组织渗透性好, 在组织和血液中的清除率快，容易与其他功能分子重组，形成多功能抗体［2-4］.另外，单链抗体能够在原核系统中高效表达，有利于大批量生产.CD3分子是T淋巴细胞膜上特有的重要信号分子之一［5，6］.抗CD3单链抗体与其他功能分子结合所形成的双功能抗体在免疫调节和肿瘤治疗方面以显示出良好的应用前景［7，8］.我们构建了抗CD3单链抗体基因，利用噬菌体展示技术表达单链抗体，通过免疫筛选，获得CD3特异基因工程抗体.该抗体为双功能抗体和重组免疫毒素的研制打下了基础.
【参考文献】
［１］Kuroki M, Arakawa F, Khare PD, Kuroki M, Liao S, Matsumoto H, Abe H, Imakiire T.Specific targeting strategies of cancer gene therapy using a singlechain variable fragment (scFv) with a high affinity for CEA［J］. Anticancer Res, 2000;20(6A):4067-4071.
［2］Takemura S, Asano R, Tsumoto K, Ebara S, Sakurai N, Katayose Y, Kodama H, Yoshida H, Suzuki M, Imai K, Matsuno S, Kudo T, Kumagai I. Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system［J］. Protein Eng, 2000 ;13(8):583-588.
［3］Weetall M, Digan ME, Hugo R, Mathew S, Hopf C, TartRisher N, Zhang J, Shi V, Fu F, HammondMcKibben D, West S, Brack R, Brinkmann V, Bergman R, Neville D Jr, Lake P.Tcell depletion and graft survival induced by antihuman CD3 immunotoxins in human CD3 epsilon transgenic mice［J］.Transplantation, 2002;73(10):1658-1666.
［4］Hexham JM, Dudas D, Hugo R, Thompson J, King V, Dowling C, Neville DM Jr, Digan ME, Lake P. Influence of relative binding affinity on efficacy in a panel of antiCD3 scFv immunotoxins［J］.Mol Immunol, 2001;38(5):397-408.
［5］Hombach A, Wieczarkowiecz A, Marquardt T, Heuser C, Usai L, Pohl C, Seliger B, Abken H. Tumorspecific T cell activation by recombinant immunoreceptors: CD3 zeta signaling and CD28 costimulation are simultaneously required for efficient IL2 secretion and can be integrated into one combined CD28/CD3 zeta signaling receptor molecule［J］.J Immunol, 2001;167(11):6123-6131.
［6］张文霁,韩泉洪，惠延年，马吉献. 增生性玻璃体视网膜病变组织中的T淋巴细胞与HLADR抗原［J］.第四军医大学学报,2001；22(10)：916-918.
［7］Wuest T, Moosmayer D, Pfizenmaier K.Construction of a bispecific single chain antibody for recruitment of cytotoxic T cells to the tumour stroma associated antigen fibroblast activation protein［J］.J Biotechnol, 2001;92(2):159-168.
［8］栗艳，阎露. 吸烟对T，B淋巴细胞的影响［J］. 第四军医大学学报,2001；22(13)：1191-1193.。
