第三章 动物细胞工程制药_PPT幻灯片

3.转化细胞系 异倍体细胞，没有正常细胞的特点，可以无限增殖。 自发形成：啮齿动物。
人工转化：病毒或化学试剂。
4.融合细胞系
细胞融合是指两个或两个以上细胞合并成一个细胞 的过程。
诱导 仙台病毒和聚乙二醇（PEG） 高压电场的电融合
（1）仙台病毒融合法
少用（感染困难、融合慢、去病毒困难）
①病毒加入两种细胞后，4℃条件下，病毒附着在两种细胞 的细胞膜上，使两种细胞互相凝聚。 ②在37℃条件下，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破 坏； ③两个细胞的连接部位穿通，周边连接部修复。 ④细胞融合。
二、生产用动物细胞的获得
生产中的动物细胞有：原代细胞、二倍体细胞系、无限 传代细胞系和利用上述3种细胞进行融合和重组的工程细胞系 。
1.原代细胞
直接取自动物组织、器官。
2.二体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的 组织中挑选并纯化出具有某些特征的细胞株，这类细胞仍 然是二倍体核型，具有贴壁依赖和接触抑制特性，无致瘤 性，一般从动物胚胎组织中获取。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
磷酸钙沉淀法和电穿孔法。
磷酸钙沉淀法是将溶解的DNA加在Na2HPO4溶液内， 再逐渐加入CaCl2溶液，当二者形成磷酸钙沉淀时，DNA被 包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当该沉淀与细 胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入其中。
可以在培养液中呈悬浮状态良好地生长。
二、动物细胞的分化组成和代谢
1.动物细胞的化学组成
水、无机盐、蛋白质、糖、脂类和核酸组成。 细胞中水占绝大多数，占细胞鲜重的85%-95%，无机 盐占1.5%，蛋白质占7%-10%，脂类占1%-2%，其他物质 占1.5%。
2.动物细胞的代谢 糖、脂、蛋白质等有机物大分子的代谢一般都可以分成
动物细胞高度分化。
离体培养的细胞可分为两类：贴壁依赖型细胞和贴壁 非依赖型细胞，前者可简称为贴壁细胞，后者简称为悬浮 细胞。
2.悬浮细胞 悬浮细胞的生长不依赖支持物表面，可以在培养液中呈
悬浮状态生长（血液中的淋巴细胞、Namalwa cell）
3.兼性贴壁细胞 既可以贴附于支持物表面生长，在一定的条件下，也
三个降解阶段：
①生物大分子降解为小分子； ②小分子物质进一步代谢转化为三个主要的中间产物——乙 酰辅酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸； ③三种中间产物进入TCA循环，为动物的生命活动供能。
在氧气供应不足或者剧烈运动造成的局部缺氧时，动 物细胞可以进行无氧呼吸——糖酵解供能。
在动物细胞的体外培养中，供能物质主要是葡萄糖和 谷氨酰胺。
（2）聚乙二醇融合法
产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备。
（3）电融合法 利用电场进行人工诱导细胞融合，是利用细胞在短时间
的电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，而使相邻的细 胞的细胞膜相互发生继发性融合。
操作简便、无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步和融合 率高，可在显微镜下直接观察融合情况。
5.重组工程细胞系 利用基因工程技术手段重组的各种细胞系。
第一节 概述
细胞工程：以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生 物学、分子生物学等理论和技术，有目的的进行精心设计、 精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良 或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种 特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖， 并提取对人类有用的产品的一门科学。
三、基因工程细胞的构建和筛选
1.真核细胞基因表达载体的构建
载体
病毒载体 质粒载体
腺病毒 杆状病毒
杆状病毒作为载体的优点： （1）杆状病毒基因组是双链DNA，容易进行重组； （2）可插入较大片段的外源表达基因，插入7-8kb外源基 因而不影响正常病毒粒子的形成； （3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外 源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染能力的病毒 粒子； （4）多角体蛋白基因有强启动子，蛋白表达量较高； （5）多角体是一个明显的标记物，可以直接用显微镜观察 ，易于筛选阳性克隆； （6）如果是家蚕杆状病毒作载体，可以直接在家蚕体内进 行外源基因表达。
有癌变的特点，但并不是癌细胞；癌细胞可以通过无限增殖成为无限细胞系 。
4.动物细胞对周围环境敏感
动物细胞有膜无壁。
5.动物细胞对培养基的要求高
至少12种必需的氨基酸、8种以上的维生素、必要的 无机盐和微量元素、作为碳源的葡萄糖，还需要多种细胞 生长因子和贴壁因子才能生长。
不同的细胞对培养基的要求也会有所不同。
细胞工程是一门应用科学和工程技术，具体包括： 真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术 细胞融合的理论和技术 细胞器特别是细胞核抑制的理论和技术 染色体改造的理论和技术 转基因动植物的理论和技术 细胞大量培养的理论和技术 有关产物提取纯化的理论和技术
第二节 动物细胞的形态和生理特性
一、动物细胞的形态
用于临床。
利用动物细胞作为宿主细胞生产药品缺点： 培养条件苛刻，成本高，产量低。
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求
不是所有的动物细胞都可以用于生产人用的药品。
原代细胞→二倍体细胞→异倍体细胞 现在基本上已经取消了生产用动物细胞必须用传代细 胞的限制，但是对最终产品中的DNA含量做了严格的要求 。
三、动物细胞特点
1.细胞的分裂周期长 同细菌、酵母比较 不同种属、同种属不同组织比较
2.细胞生长需贴附基质，并有接触抑制现象（密度依赖抑 制）
二倍体特有。
3.正常细胞的生长寿命是有限的
细胞从离体培养开始，我们称之为原代培养，随后细胞经 过传代后，即成为有限细胞系。
细胞经过一些人为的或自然的因素转化为异倍体后，细胞 就可转变为无限细胞系，或称连续细胞系。这种细胞的寿命是 无限的，适合工业化生产的需要。
6.动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物蛋白合成场所：游离核糖体和糙面内质网结合的核 糖体。 游离核糖体：细胞质基质内蛋白； 糙面内质网结合核糖体：分泌蛋白和膜中整合蛋白，修 饰后成为糖蛋白。
细菌：无糙面内质网。
利用动物细胞作为宿主细胞生产药品优势： ①蛋白多分泌到细胞外，易于收集和纯化； ②具有完善的翻译后修饰系统，产物更接近天然，适