白腐真菌处理染料孔雀石绿的研究

养殖与饲料2017年第8期图1孔雀石绿、无色孔雀石绿及其脱甲基衍生物的结构式摘要孔雀石绿（C 23H 25N 2Cl ，Malachite Green ，MG ）是一种三苯甲烷类化工染料，因其外观颜色呈孔雀绿而得名，在动物体内，孔雀石绿通过生物转化成无色孔雀石绿蓄积于动物组织中。

自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂等在水产养殖中出现，而后因为具有价格低廉、效果显著等优点，被广泛应用于预防与治疗各类水产动物的水霉病和对原虫的控制，但随着研究的深入，孔雀石绿潜在的具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等毒副作用受到关注。

因此，对于如何清除水体中孔雀石绿残留以及改善水环境污染的研究显得极其重要，本文将阐述国内外对于孔雀石绿降解方法的研究进展。

关键词孔雀石绿；降解方法；研究进展孔雀石绿降解方法的研究进展赵桐桐1，2李文悦1，3李继丰1张建雄1周鑫1*1.河北省唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山063000；2.河北北方学院，河北张家口075000；3.天津师范大学生命科学学院，天津300387收稿日期：2017-05-04*通讯作者赵桐桐，女，1995年生。

1孔雀石绿的化学性质孔雀石绿（C 23H 25N 2Cl ，Malachite Green ，MG ）是一种三苯甲烷类化工染料，又称碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，是一类具有较强杀菌能力的染料类药物[1]。

它是一分子苯甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形成的深绿色晶体，因其外观颜色呈孔雀绿而得名。

分子式为C 23H 25N 2Cl ，相对分子质量为365，易溶于水和乙醇。

孔雀石绿多以草酸盐（malachite green oxalate ，C 23H 25N 2+HC 2O 4-）形式制备并在市面上出售，盐酸盐（malachite green chloride ，C 23H 25N 2+Cl -）比较少见。

图1列出了孔雀石绿、无色孔雀石绿及一系列脱甲基衍生物的结构式[2]。

白腐真菌处理染料孔雀石绿的研究作者：沈丹玉赵丽红许海瀛崔晓玲辛书扬佟广恩来源：《科技创新与应用》2015年第08期摘要：实验研究了白腐真菌B在不同振荡条件下、不同染料浓度、不同碳源浓度等环境因素对孔雀石绿脱色效果的影响。

实验结果表明菌株B在染料浓度为100mg·L-1，振荡速度为150r·min-1，碳源浓度为20g·L-1时，其脱色率最高。

关键词：白腐菌；染料；孔雀石绿；脱色孔雀石绿是一种合成染料，广泛应用于水产养殖业，在养殖鱼类中作为杀菌剂来防治原生动物和真菌感染。

在纺织品和皮革工业，被用来给丝绸、羊毛和皮革等进行染色[1]。

然而使用这种染料会产生大量问题，因为孔雀石绿具有毒性较高，致癌、致畸、致突变等副作用。

而且毒性效应会随着接触时间、温度和浓度而增加，其消除速率非常缓慢[2]。

因此，需要找到一种从池塘和工业废水中去除过量/残留孔雀石绿的有效方法。

人们采用各种非生物方法，但是需要昂贵的催化剂和试剂，这本身是不环保的。

而利用微生物分泌的酶是消除这种染料最好的方式，具有环境友好性。

白腐真菌，是分解合成染料非常有效的类群，然而微生物降解孔雀石绿是很难的，因为它具有杀菌性，从而阻止了原生物修复策略的执行。

但是白腐真菌分泌的木质素降解酶能够降解这类污染物，对脱色具有良好的效果[3]。

本实验通过研究白腐真菌对孔雀石绿的降解，研究了不同振荡情况、不同染料浓度、不同培养时间等条件下对染料孔雀石绿的脱色效果的影响。

1 实验材料与方法1.1 实验材料与仪器菌株：白腐真菌糙皮侧耳B（本实验室保存菌种）。

其他材料：孔雀石绿，土豆，琼脂，葡萄糖，硫酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1。

实验仪器：紫外-可见分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，振荡培养箱，电子分析天平，恒温培养箱。

1.2 实验方法1.2.1液体培养基葡萄糖20g·L-1，（NH4）2SO40.5g·L-1，KH2PO42g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，VB10.02g·L-1。

孔雀石绿染料的微生物脱色研究孔雀石绿（Malachite green）别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、苯胺绿、维多利亚绿或中国绿，亦为一种生物染色剂染料。

孔雀石绿过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，1933 年起其作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。

从上世纪90 年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高毒素、高残留、高致癌和高致畸、致突变等副作用[1]。

许多研究表明，微生物具有极高的降解有机染料的能力，目前分离到的脱色微生物主要有真菌、藻类和细菌[2]。

但目前已报道的脱色菌的效率不高，且耐受孔雀绿染料的范围较低[3,4]。

本试验以高浓度孔雀绿染料为筛选底物，从活性污泥中分离出脱色菌，，能耐受并脱色降解较高浓度的孔雀绿染料，脱色能力强，且脱色速率高.1 实验设计方案与思路1.1 活性污泥分离纯化1.2 单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养1.3 不同单菌种对染料的降解实验：在三角瓶的液体培养基中加少量染料溶液(1000mg/L）和活性污泥，摇床培养，测定脱色率。

确定高效脱色菌种。

1.4 对菌种进行初步鉴定（菌种的形状、革兰氏染色）2 实验方法[5]2.1 活性污泥分离纯化配培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，NaCl 5g，pH:7.0~7.2，15-25g/l 琼脂，配置的时候先配液体培养基，再加琼脂配固体培养基，然后分装成六个液体培养基（每个约100ml）和一个固体培养基，塞上棉塞，包扎好，待灭菌。

把实验要用到的实验仪器用报纸包好，用细线扎好，连同培养基一起放入高压蒸汽灭箘法灭菌。

倒平板经灭菌后的固体培养基冷却至50摄氏度左右倒入3个无菌培养皿中，冷凝成平板。

稀释样品将1瓶90 ml和5管9 ml的无菌水排列好，按10-1、10-2、、、10-6依次编号。

孔雀石绿脱色研究1 引言合成染料广泛应用于印染、制皮、化妆品、印刷、医药和食品加工等行业，然而，这些染料大多数都具有生物毒性和致畸致癌性，而且在自然环境中极难生物降解，对光、生物酶和其他环境条件的抵抗力极强.孔雀石绿作为一种三苯甲烷类染料，广泛应用于水产养殖业、食品加工业、医药行业等各个领域中.随其广泛使用，该染料对哺乳动物细胞、水生生物和其他有机生命体的致癌致畸效应也凸现出来，引起了科学界的广泛关注.因此，在许多国家和地区，该染料已被立法严禁使用，且被美国食品和药物管理局列为致癌性测试的优先化学物质之一.然而，由于孔雀石绿的生产成本较低、稳定性强且使用效果较好，难以找到合适的替代物，导致很多地区仍在广泛使用该染料，严重破坏了使用地区的生态平衡尽管许多科学工作者已致力于解决由孔雀石绿造成的环境污染问题，例如应用吸附、化学沉淀、光降解、渗透和膜过滤等理化处理技术处理污染水源;然而，由于这些处理方法不仅处理费用高、效率不高，而且在治污的同时容易产生二次污染和难以处置的底泥，因此，极大地限制了其广泛推广使用.生物处理技术作为一种环境友好型且高效低耗的处理手段受到越来越广泛的关注.其中，细菌由于生长速度快，容易获得大量生物量，且易产生大量降解相关酶，对染料的降解效率也较高等优势而受到环境工作者的青睐.本研究的目的在于：①广泛筛选浙南地区的MG高效脱色菌株;②初步鉴定MG高效脱色菌株为DH-9;③采用单因素实验研究菌株DH-9对MG的脱色特性，并采用响应面设计优化脱色条件.2 材料与方法2.1 实验材料 2.1.1 菌种来源供试土样取自浙江温州双屿皮革城和温州大罗山果园，菌株DH-9来源于常年被皮革废水污染的污泥中.2.1.2 试剂孔雀石绿属于三苯甲烷类染料，购自国药集团化学试剂有限公司;革兰氏染色液;TE缓冲液;Tris饱和酚(pH 8.0);氯仿;10×PCR缓冲液、DNA 连接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司);DNA 纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)等.其它生化试剂均为国产分析纯.2.1.3 培养基无机盐培养基(MSM)组成(g · L-1)：Na2HPO4，15.13;KH2PO4，3.0;NaCl，0.5;NH4Cl，1.0;MgSO4 · 7H2O，0.491;CaCl2 · 2H2O，0.026;pH 7.0.LB培养基组成(g · L-1)：蛋白胨，10;酵母膏，5;NaCl，10;pH 7.0~7.2.纯化培养基组成(g · L-1)：在MSM培养基中添加终浓度为200 mg · L-1的MG染料.2.2 实验仪器超净工作台;电热恒温鼓风干燥箱;高压蒸汽灭菌锅;全温恒温摇床;电子天平;pH计;高速冷冻离心机;Evolution 260紫外可见光分光光度计;Bio-rad PCR仪、自动凝胶图像分析仪及水平电泳仪等.2.3 实验方法 2.3.1 MG高效脱色菌株的富集、分离和纯化方法将1.0 g土样接入已灭菌的含100 mL MSM培养基的三角瓶中，同时在MSM培养基中添加已过滤除菌的MG母液作为唯一碳源，使其终浓度为20 mg · L-1.将三角瓶置于30 ℃、180r · min-1摇床中振荡培养1周后，吸取1 mL培养液转接至新鲜培养基(含40 mg · L-1的染料)中，连续驯化、富集.转接多次后，培养物可耐受的染料终浓度为200 mg · L-1.用接种环蘸取少许富集培养液，在纯化培养基平板上直接划线分离.在平板上选择不同形态特征的单菌落，重新转接至含200 mg · L-1 MG的纯化培养基平板上，转接多次直至获得单一形态的MG脱色菌纯培养物.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR扩增与序列分析(1)提取基因组DNA：采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，具体步骤参考《分子克隆实验指南》.(2)16S rRNA基因PCR反应：用于菌株DH-9 16S rRNA基因PCR反应的引物为一对通用引物，正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′;反向引物BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3，PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程有限责任公司完成.所得序列用BLAST 程序与GenBank数据库(/blast)中的菌株进行比对，选取一些具有代表性的菌株用于系统发生树的构建.采用软件CLUSTAL X 1.8.3进行DNA序列同源性比较.比对结果用MEGA 4.1软件中的Neighbor-Joining的距离模进行UPGA分析后生成系统发育树.2.3.3 菌株DH-9对MG的脱色特性研究(1)培养基起始pH值对MG脱色的影响：用1.0 mol · L-1的HCl或NaOH将2.0 g · L-1酵母粉溶液的初始pH值分别调整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.灭菌后添加过滤除菌的MG，使MG终浓度为100 mg · L-1，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养.(2)培养温度对MG脱色的影响：分别设定培养温度为15、20、25、30、35和40 ℃.在2.0g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V∶V)，并于180 r · min-1条件下振荡培养.(3)接种量对MG脱色的影响：在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，分别接种1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%(V：V)的菌株DH-9过夜培养物，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养.(4)碳氮源对染料脱色的影响实验：将所选碳源(葡萄糖、麦芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖和蔗糖)分别添加至MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g · L-1.将所选氮源(NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸)分别添加至无NH4Cl的MSM培养基中，使其终浓度为2.0 g · L-1.灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V∶V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).(5)金属离子对MG脱色的影响：分别向2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加终浓度为1.0和2.0 mmol · L-1的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，灭菌后添加过滤除菌的终浓度为100 mg · L-1的MG，接种等量菌株DH-9过夜培养物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1条件下振荡培养(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).所有实验均重复3次以上，并同时设置对照实验.2.3.4 响应面设计优化菌株DH-9对MG的脱色条件在单因素实验的基础上，采用中心组合试验设计(Central Composite Design，CCD)对MG脱色条件进行优化，培养8 h后测定其脱色率.用标准多项式回归方法，对CCD设计实验数据进行拟合，得到一个二次多项式：式(1)中，Y为预测目标函数;β0为常数;βi为线性系数;βii为平方系数;βij为交互作用系数.本实验采用五因素三水平CCD设计来研究操作参数对MG脱色的影响，具体设计如表 1所示.2.4 数据统计分析CCD实验设计数据采用Minitab 14.0软件进行统计分析.3 结果与分析 3.1 MG高效脱色菌株的筛选与鉴定经多次富集、纯化培养后，获得了多株对MG有一定脱色能力的菌株，其中菌株DH-9对MG 的脱色效果最好，同时，全波长扫描结果显示脱色后有新的吸收峰产生(数据未给出)，加之脱色后菌体沉淀呈现无色，推测该菌株对MG的脱色可能是由生物降解引起的.因此，随后着重对菌株DH-9进行了鉴定.革兰氏染色结果显示菌株DH-9是革兰氏阴性菌，短杆状.菌落呈现圆形，乳白色，半透明，表面光滑湿润.以菌株DH-9基因组为模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20进行PCR扩增，检测PCR产物、回收、纯化后测序，获得1475 nt的DH-9菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登录序号为KC736654.该序列经与GenBank中的数据比对后发现，其相似度与Enterobacter aerogenes strain ATCC 13048的相似度达到98%以上，并且在系统进化树中也与该菌株聚类在一起(图未给出)，表明菌株DH-9属于肠杆菌属.3.2 菌株DH-9对MG的脱色特性 3.2.1 pH值和温度对MG脱色的影响培养基初始pH值对MG脱色影响的结果如图 1a所示.培养12 h时，pH值在4.0~9.0之间的MG培养基脱色率在90%以上.培养24 h以后，pH值在3.0~9.0之间的MG培养基脱色率均在90%以上，说明该菌株对MG脱色的pH适应性较强，实际应用潜力较大.图 1图 1 pH(a)和温度(b)对MG脱色的影响温度对MG脱色的影响结果如图 1b所示.由图可知，培养12 h时，温度为30~40 ℃间的MG 脱色率在90%以上.随着脱色时间的延长，当培养时间超过24 h后，所测温度范围内(15~40 ℃)的MG脱色率均超过90%，表明该菌株对MG脱色的最适温度范围为30~40 ℃，温度适应性较好.碳氮源对MG脱色的影响如图 2a、图 2b所示.实验结果表明，培养48 h以内时，多数所测试碳源对MG脱色有抑制效应或无显著影响;而当培养时间超过72 h后，多数所测试碳源对MG脱色有促进作用，其中以乳糖、半乳糖和果糖促进效果最为显著，总体而言，所测试碳源中以半乳糖对MG脱色的促进效果最好.与碳源相比，多数所测试氮源对MG脱色的促进效果优于碳源，实验中所测试的氮源均能显著促进MG脱色.有机氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和谷氨酸)比无机氮源(NH4Cl和NaNO3)的促进效果要好，其中尤以酵母粉、谷氨酸和甘氨酸的促进效果最好.图 2图 2 碳(a)、氮(b)源和金属离子(c)对MG脱色的影响 (1.1.0 mmol · L-1氯化铜; 2.2.0 mmol · L-1氯化铜; 3.1.0 mmol · L-1氯化铁; 4.2.0 mmo · L-1氯化铁; 5.1.0 mmol · L-1氯化钙; 6.2.0 mmol · L-1氯化钙; 7.1.0 mmol · L-1氯化锌; 8.2.0 mmol · L-1氯化锌;9.1.0 mmol · L-1氯化镁; 10.2.0 mmol · L-1氯化镁; 11.1.0 mmol · L-1氯化锰; 12.1.0 mmol · L-1氯化锰) Fig. 2 The effect of carbon(a)，nitrogen(b)resources and metal ions(c)on MG decolorization(1.1.0 mmol · L-1 CuCl2; 2.2.0 mmol · L-1 CuCl2; 3.1.0 mmol · L-1 FeCl3; 4.2.0 mmol · L-1 FeCl3; 5.1.0 mmol · L-1 CaCl2; 6.2.0 mmol · L-1 CaCl2; 7.1.0 mmol · L-1 ZnCl2; 8.2.0 mmol · L-1 ZnCl2; 9.1.0 mmol · L-1 MgCl2; 10.2.0 mmol · L-1 MgCl2; 11.1.0 mmol · L-1 MnCl2; 12.1.0 mmol · L-1MnCl2) 金属离子对MG脱色的影响如图 2c所示.由图可知，大多数所测试金属离子对MG脱色没有显著效应，仅Cu2+和Fe3+对MG脱色有显著抑制效应，钙离子对脱色有微弱促进效应.3.2.3 接种量对MG脱色的影响接种量对MG脱色的影响结果如图 3所示.当接种量从1%上升至3%时，MG脱色率上升趋势显著;而当接种量继续增大时，MG脱色率变化趋势则趋于平稳，均维持在90%以上.图 3图 3 接种量对MG脱色的影响3.3 菌株DH-9对MG的最优脱色条件 3.3.1 回归方程和预测模型的构建采用CCD设计优化MG的脱色条件和研究主效应因子间的交互作用，实验结果和模型预测结果如表 1所示.实验所得培养8 h后的孔雀石绿的脱色率分布在78.0%~99.2%之间，说明主效应因子对MG脱色影响显著.MG脱色率的实验值和预测值基本保持一致，说明所获得模型精确性较高.所获得模型的回归系数和统计学分析(ANOVA)结果如表 2和表 3所示.结果显示，模型的决定系数R2和校正决定系数(adjusted R2)分别为99.7%和99.2%，这就说明该模型精确性较高，可以用于MG脱色率的预测.因此，适于预测MG脱色率的二次模型公式可表示如下：式(2)中，DP是MG的脱色率，A到D是CCD设计的5个自变量，分别为pH、温度、半乳糖、酵母粉和氯化钙浓度.回归分析的F值和p值分别为201.26和<0.001，这说明该模型的显著性较高.线性和交互作用选项的p值也<0.001，这说明线性选项和交互作用选项AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE对MG脱色的影响显著.此外，“lack of Fit”选项的F值和p值分别为4.57和0.058，说明相对于纯误差“lack of Fit”不显著，进而说明该模型与响应值(MG的脱色率)的拟合效果较好.3.3.2 主效应因子间的相互作用用Minitab 14.0软件分析获得的因素间交互作用的2D图如图 4～6所示.图 4显示了pH 和半乳糖、酵母粉、氯化钙浓度之间的交互作用及其对脱色的联合影响，结果表明pH和这3种因素之间的交互作用显著.如图所示，随着pH值逐渐升高，脱色率随半乳糖和酵母粉浓度的升高而逐渐降低，但其随氯化钙浓度的升高则呈现出先升高再降低的趋势.图 4图 4 pH和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响图 5显示了温度和半乳糖、酵母粉、氯化钙浓度之间的交互作用及其对脱色的联合影响，结果表明温度和这3种因素之间的交互作用显著.由图可知，随着温度逐渐升高，脱色率随半乳糖和酵母粉浓度的升高而逐渐降低，但其随氯化钙浓度的升高则呈现出先降低再升高的趋势.图 5图 5 温度和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响图 6显示了半乳糖浓度和酵母粉、氯化钙浓度之间以及酵母粉浓度和氯化钙浓度之间的显著的交互作用及其对脱色的联合影响.图 6a和6b表明随着半乳糖浓度的逐渐升高，脱色率随酵母粉和氯化钙浓度的升高而呈现降低趋势.由图 6c可知，随着酵母粉浓度的逐渐升高，脱色率随氯化钙浓度的升高也呈现降低趋势.图 6图 6 半乳糖和酵母粉(a)、氯化钙(b)及酵母粉和氯化钙(c)浓度对MG脱色的影响3.3.3 预测模型的验证为了确定CCD实验所获得二次模型的精确性，我们进行了验证实验.由软件分析获得的最优操作参数如下：pH值为6.0，半乳糖、酵母粉和氯化钙浓度分别为1.0 g · L-1、1.0 g · L-1和3.0 mmol · L-1，培养温度为34.5 ℃.在此条件下进行的验证实验结果表明孔雀石绿的最高脱色率为99.4%，在置信范围(100%±1%)区间内，因此，该模型对响应值的拟合效应较好.具体参见污水宝商城资料或更多相关技术文档。

山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。

本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。

利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。

结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。

本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。

关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。

白腐真菌及其漆酶的应用研究白腐真菌是一类产生漆酶的真菌，广泛存在于自然界中，能够分解植物纤维素和木质素。

漆酶是一种蛋白质，具有高度催化活性，能够氧化各种有机物质。

因此，白腐真菌及其漆酶的应用研究在多个领域具有重要意义。

首先，在生物质能源转化中，白腐真菌及其漆酶的应用得到了广泛关注。

生物质能源是可再生能源的重要组成部分，其潜在资源非常丰富。

然而，植物纤维素和木质素的高度结晶性和抗酶解性限制了生物质的高效转化。

而白腐真菌及其漆酶能够有效降解植物纤维素和木质素，促进生物质的降解和转化。

因此，基于白腐真菌及其漆酶的生物质能源转化技术可以有效提高生物质的利用效率。

其次，在环境污染治理中，白腐真菌及其漆酶的应用也具有潜力。

许多有机污染物，如农药、染料和有机废物等，对环境和人类健康造成了严重威胁。

传统的污染物处理技术通常昂贵且不具备高效环保的特点。

而白腐真菌及其漆酶通过催化氧化有机物质，能够将有机污染物降解为无毒的物质。

因此，基于白腐真菌及其漆酶的环境污染治理技术有望成为一种高效、经济和环保的处理方法。

此外，白腐真菌及其漆酶的应用还可以推动生物医药领域的发展。

近年来，特别是在抗癌药物的研发方面，白腐真菌及其漆酶被广泛用于合成生物活性化合物。

漆酶作为一种催化剂，具有选择性催化和高效的特点，能够催化各种有机合成反应，合成具有药理活性的化合物。

因此，基于白腐真菌及其漆酶的生物活性化合物合成技术极大地推动了新药研发的进程。

综上所述，白腐真菌及其漆酶在生物质能源转化、环境污染治理和生物医药等领域的应用研究具有重要的意义。

随着对可再生能源、环境保护和药物研发的需求不断增加，相信白腐真菌及其漆酶的应用将继续得到进一步的研究和开发。

孔雀石绿降解菌的筛选及降解研究的开题报告一、选题背景孔雀石绿是一种禽畜养殖中常用的抗菌药物，但其在生产和用药过程中容易残留在动物产品中，对人体健康产生潜在危害。

因此，孔雀石绿在各国的监管中被列为限制或禁止使用。

但是，由于其化学性质稳定，常规的物理和化学处理方法难以有效去除孔雀石绿。

因此，孔雀石绿降解菌的筛选及降解研究具有重要的理论和实际意义。

二、选题目的本研究旨在通过筛选具有高效降解孔雀石绿能力的菌株，并探究其降解孔雀石绿的机理和途径，为孔雀石绿的污染治理提供新的技术手段和理论支持。

三、研究内容与方法（一）菌株筛选：在禽畜养殖废水和土壤样品中筛选出具有高效降解孔雀石绿能力的菌株。

方法：利用孔雀石绿为唯一碳源进行菌株筛选，采用常规细菌学和分子生物学方法对菌株进行鉴定和分类。

（二）降解实验：对筛选出的菌株进行降解实验，考察不同降解条件对降解效果的影响。

方法：在不同条件下进行降解实验，如不同底物浓度、温度、pH值等条件，同时通过高效液相色谱法(HPLC)对底物和降解产物进行检测和分析，以确定降解效果。

（三）降解机理研究：通过分析降解产物和代谢途径，探究菌株降解孔雀石绿的机理和途径。

方法：采用色谱质谱联用技术（LC-MS）对降解产物进行分析和鉴定，同时结合代谢途径推测和酶活性检测等方法，研究降解机理和途径。

四、预期结果和意义本研究预计筛选出一株具有高效降解孔雀石绿能力的菌株，并对其降解机理进行深入研究，为孔雀石绿的污染治理提供新的技术手段和理论支持。

同时，本研究建立的研究方法也有望为其他有机污染物降解研究提供借鉴和参考。