羟脯氨酸检测试剂盒说明书

目录I. II. III.IV. 入门指南 a.处理要求b.为氨基酸分析设置自动移液平台c.准备Tecan Freedom EVO 100/4d.试剂制备e.校准品、质量控制标准品、内标和 AccQ•Tag 复溶说明f.试剂布局g.样品分发和条形码h.执行自动样品制备脚本V. 推荐的分析方法VI. 工作流程概述VII.订购信息I. 简介收货后请核对试剂盒清单，如果包装被打开、损坏，内容物缺失或超出有效期，请勿使用本产品。

如需订购替换试剂盒或部件，请联系当地的销售代表。

订购时请提供所需产品的产品部件号和批号。

Waters Kairos 氨基酸试剂盒 - 自动Waters AccQ•Tag 试剂。

NNO NH OOO简介保存和稳定性使用Kairos氨基酸分析试剂盒a.Kairos 氨基酸LC 分析方法b.Kairos 氨基酸MS 分析方法非常感谢您购买Waters™ Kairos™氨基酸试剂盒，此试剂盒仅供研究使用。

本文将介绍Kairos 氨基酸试剂盒(仅供研究使用)的常规维护和使用信息，以期协助您精准测定血浆和尿液样品中的氨基酸。

本文中的方法已经使用AccQ•Tag™衍生化试剂、ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS 系统、Xevo™ TQ-S micro 和ACQUITY QDa™质谱检测器进行了验证，但我们仍建议您根据具体样品优化分析条件并确认分析结果是否准确，尤其是当样品不完全符合工作站及脚本要求时。

为了确保通用性，该试剂盒中所有试剂的量都经过相应扩大，可适应不同自动移液工作站的残留体积要求。

沃特世不提供有关自动化的咨询服务。

如果需要根据特定工作站的要求进行任何调整，建议您直接联系移液工作站供应商寻求帮助。

如果偏离了脚本或工作站要求，用户应自行确保结果准确度得到确认。

本维护和使用手册针对该方案的实施提供了十分详细的分步操作说明。

如需观看该方案的完整培训视频，请访问：/Kairos 。

脯氨酸（Pro ）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0290规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体45 mL×1瓶（自备）4℃保存试剂二液体45 mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1．试剂一：自备冰乙酸。

2．标准品：脯氨酸10 mg ，临用前加入1 mL 蒸馏水，配成10 mg/mL 标准品。

产品说明：脯氨酸（Pro ）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。

Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。

因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

用磺基水杨酸（SA ）提取Pro ，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色，在520nm 测定吸光度。

技术指标：最低检出限：0.1791 μg/mL 线性范围：0.5-40 μg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器及用品：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰乙酸、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细胞、细菌或组织样本的制备：细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min ；10000g ，常温离心10min ，取上清，冷却后待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。

CellBiolabs羟脯氨酸检测试剂盒分析原理羟脯氨酸是一种由不可逆的翻译后酶合成的氨基酸脯氨酸经脯氨酰羟化酶羟化。

羟脯氨酸几乎只存在于细胞中蛋白质胶原蛋白，位于重复三肽Gly-X-Y的Y位置。

通过允许胶原蛋白螺旋，羟脯氨酸有助于稳定胶原蛋白的结构。

除了胶原蛋白，在转录因子缺氧诱导因子（HIF1）上观察到脯氨酸的羟基化。

在正常氧气条件下，蛋白质EGLN1在脯氨酸564处羟基化HIF-1α，允许von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子（pVHL）泛素化并导致靶向性通过蛋白酶体降解HIF-1。

由于羟脯氨酸仅存在于胶原蛋白以外的少数蛋白质中，因此羟脯氨酸已被用作量化胶原蛋白和/或明胶水平的标志物（部分胶原蛋白水解产生蛋白质和肽的混合物）。

据估计羟脯氨酸占胶原蛋白的13.5%。

此外，还使用了羟脯氨酸测量确定某些涉及胶原蛋白分解的疾病。

例如，增加了在佩吉特骨病患者的血清中测定了胶原蛋白。

此外，羟脯氨酸增加该水平与前列腺癌、骨转移、肝纤维化以及前列腺癌相关三聚氰胺和三聚氰酸引起肾毒性。

Cell Biolabs/羟脯氨酸检测试剂盒为检测提供了一种方便的比色方法从组织、血浆、血清或尿液酸水解物中提取总羟脯氨酸。

首先是未知将样品或羟脯氨酸标准加入96孔板中。

然后，加入氯胺T混合物添加以将羟脯氨酸转化为吡咯。

最后，4-（二甲氨基）苯甲醛（DMAB）将混合物（也被称为埃利希试剂）添加到与吡咯反应的孔中，以使其反应产生生色团（下图），并在540-560 nm处读取板的吸光度。

内容通过与预定值进行比较，确定未知样品中羟脯氨酸的含量羟脯氨酸标准曲线。

提供的试剂足以评估96次分析包括标准品和未知样品。

（分析原理）1. STA-670: Homocysteine ELISA Kit2. STA-671: S-Adenosylhomocysteine (SAH) ELISA Kit3. STA-672: S-Adenosylmethionine (SAM) ELISA Kit4. STA-674: Glutamate Assay Kit。

羟自由基测定试剂盒使用说明货号：LA1950规格：50管/48样产品内容：试剂一：3%H2O2标准品贮备液0.5mL×1支，4℃保存3个月。

0.03%标准品应用液的配置：3%H2O2标准品贮备液：双蒸水=1：99稀释，现用现配。

试剂二：底物贮备液1mL×1支，4℃保存3个月。

底物应用液的配制：如果您的样本为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，则底物反应液的配制：底物贮备液：双蒸水=1：99稀释，现用现配。

如果您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度高，则底物反应液的配制：底物贮备液：双蒸水=1：299稀释，现用现配。

试剂三：甲液贮备液2mL×1支，4℃保存3个月。

用时用双蒸水稀释至1：9稀释成应用液。

乙液7mL×2支，4℃保存3个月。

试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比列混合，按需配置，剩余的4℃保存。

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存3个月。

用时加双蒸水稀释至100mL制备应用液，4℃保存。

若有结晶，则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。

试剂五：液体30mL×1瓶，避光4℃保存3个月。

试剂六：液体30mL×1瓶，避光4℃保存3个月。

试剂七：分析纯的冰乙酸自备。

显色剂的配制：试剂四应用液：试剂五：试剂六：冰乙酸=8:3:3:2，现用现配。

抑制羟自由基的物质如：血清（浆）、各种组织匀浆液、口服液等产生羟自由基的物质如：中性白细胞、某些药物、部分植物等。

产品简介：Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH·量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH·的多少成正比列关系。

操作步骤：以上配制好的应用液，先在37℃水浴中温育3min，一下操作在37℃水浴中进行。

空白管标准管对照管测定管双蒸水（mL）0.40.20.20.03%H2O2标准应用液（mL）0.2底物应用液（mL）0.20.2样本（mL）0.2试剂三应用液（mL）0.40.40.40.4混匀，37℃反应1min（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到1min结束，立即加入显色剂终止反应，一次只能做一个管子。

小鼠羟脯氨酸(Hyp)酶联免疫分析试剂盒使用说明书产品编号：E0621m3. 蒸馏水或去离子水，全新滤纸标本的采集及保存1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

4. 组织匀浆：将动物的组织标本先用PBS洗涤，去除多余血液，匀浆化后放在20ml PBS中于-20℃放置过夜，第二天，经过二次反复冻融破膜，将匀浆物5000x g离心5分钟，取上清即可检测。

注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。

每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。

3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

原料中羟脯氨酸含量的测定1.材料和试剂1.1材料秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。

秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。

秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。

1.2试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。

1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。

冷却至室温后用水定容。

1.2.3缓冲溶液（PH=6.8）包括下列组分：a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）；b）14.0g氢氧化钠；c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。

用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。

该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。

1.2.4氯胺T溶液称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。

临用前配制。

1.2.5显色剂称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。

临用前配制。

1.3羟脯氨酸标准溶液1.3.1标准储备液称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。

该溶液于4℃下可稳定存放1个月。

1.3.2标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。

分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5µg/mL、1.0µg/mL、1.5µg/mL、2.0µg/mL。

临用前配制。

2.仪器和设备3.试样制备用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。

将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。

1羟脯氨酸含量测定2羟脯氨酸标准曲线绘制3试剂的配制【6-7】[6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559[7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。

0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。

对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。

3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。

羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。

羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。

4标准曲线绘制分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。

以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。

绵羊羟脯氨酸（Hyp）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定绵羊血清、血浆、组织等样本中羟脯氨酸（Hyp）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中绵羊羟脯氨酸（Hyp）水平。

用纯化的绵羊羟脯氨酸（Hyp）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入绵羊羟脯氨酸（Hyp），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的绵羊羟脯氨酸（Hyp）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中绵羊羟脯氨酸（Hyp）含量。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。