禽流感HI实验方法

高致病性禽流感红细胞凝集(HA)与凝集抑制(HI)试验1.原理：禽流感病毒具有凝集鸡的红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(Hl)试验，具有特异性。

通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

2.用途：用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定和抗体检测。

3.试剂：禽流感病毒标准抗原、禽流感标准阴、阳性血清、阿氏液、1%的鸡红细胞、pH7.2的磷酸盐缓冲液。

4.设备耗材：普通天平、分析天平、普通离心机、微量振荡器、微量移液器、高压灭菌器、微量移液器、V形血凝反应板、吸头等。

5.操作步骤6.1血凝试验：5.L1取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔〜12孔每孔加25μLPBS;5.L2吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3〜5次充分混匀；5.L3从第1孔中吸取25uL混匀后的病毒液到第2孔，混匀后吸取251IL加入到第3孔，依次进行倍比稀释至第11孔，最后从第11孔吸取25UL弃之，设定第12孔位PBS对照；每孔再加入25μLPBSo5.1.4每孔加入25μLl%的鸡红细胞悬液（用前将鸡红细胞悬液充分混匀）；振荡混匀反应混合液，室温（20-25。

C）静置40min后观察结果。

5.L5结果判定：在PBS对照出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集，以完全凝集的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。

完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。

5.2血凝抑制试验：1.1.11配制4单位抗原：根据血凝试验结果配制4单位抗原，以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4血凝单位抗原即为最高稀释倍数除以4。

加入抗原的血凝滴度为1:256,则4HAU抗原的稀释倍数为1:64,即ImI抗原加入到63mlPBS中即为4HAU 抗原；1.1.2取96孔V形微量反应板，用移液器在第1〜11孔各加入25ULPBS,第12孔加入50ULPBS；1.1.3第1孔加入25UL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出25μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL,第11孔做阴性对照，第12孔为PBS对照。

红细胞凝集实验（HA）与红细胞凝集抑制实验（HI）一：实验设备及仪器1.离心机一台（30000转）2.冰箱一台（存放抗原）3.振荡器一台（震荡96孔V型板）4.抗原：禽流感（AI）抗原，从厂家购买5.多孔移液器即排枪一把（量程为5到50微升，做稀释血清用）6.一次性枪头（高压灭菌后使用）7.1%到0.5%体积的鸡红细胞悬液（健康成年鸡的红细胞，但须严格洗五次）8.柠檬酸三钠（配置3.8%抗凝剂使用，制作红细胞悬液采鸡血时加入血液，防止血液凝固）9.吸管一毫升跟十毫升量程10.吸耳球：跟吸管配套使用11.蒸馏水：即无菌双蒸水，清洗96孔V型板12.10毫升离心管，离心红细胞用13.生理盐水：做血清稀释液用，及配置4单位抗原二：实验前准备1.抗原：根据指定免疫类型从生物公司购买稳定的浓缩抗原2.抗凝剂的配制：用分析天平称取3.8克柠檬酸三钠，溶解于100毫升生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1%红细胞悬液制作：去菜市场找杀鸡的，去找他们用试管接新鲜鸡血，试管中提前加入抗凝剂，加入的抗凝剂与你所接血液的比例大概为1:2，并迅速混匀，在离心机中以3000转离心五分钟，用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，不要弄碎了红细胞，再在离心机中3000转离心五分钟，弃去上清，再加生理盐水混匀，如此往复四到五次。

最后一次离心后，去掉上清，管低即为红细胞泥，用吸管吸取0.1毫升红细胞泥，然后加入9.9毫升的生理盐水就是1%的红细胞悬液，现用现配不要长时间存放。

4.被检血清：乡镇送来的血液，离心取上清即为被检验血清，注意做标记，一管一标记，别弄混了。

5.血清稀释液：为灭菌生理盐水，即高压过的生理盐水三：实验步骤第一步：血凝（HA）实验，目的是测定抗原效价，即为了制作后面的四单位抗原1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理盐水25微升2.用微量移液器吸取待测抗原（就是你买的抗原）的25微升于第一孔中并且挤压六次混合，后吸出25微升至第二孔，依次倍比稀释到第11孔，11孔中弃去25微升。

禽流感流行病抗体检测HI试验方法的诊断与预防摘要】禽流感是由A型流感病毒引起的禽类一种从呼吸系统到全身败血症等多种症状的传染病。

此后,这种疫病更名为禽流感。

高致病性禽流感发病率、死亡率高,感染的鸡群常常“全军覆没”;低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状,食量减少,产蛋量下降,出现零星死亡;非致病性禽流感不会引起明显的症状,仅使传染的禽类体内产生病毒抗体。

【关键词】禽流感流行病诊断【中图分类号】R511.7 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）49-0078-021 流行病学一般禽流感的病毒都会有很多的病种、水禽和野生的鸟类都是能够可以让禽流感传播的病菌。

家里面养的鸡和火鸡都是很容易传播病菌的，然后就是雏鸡和孔雀，鸭、鹅和鸽这样写动物都是病菌传播的比较少的。

传染源为多种带毒动物或患病动物,最重要是水禽,如鸭、鹅。

2 临床症状2.1临床表现我们常常以呼吸道和消化道症状为主。

排黄绿色粪便、产蛋下降、神经症状、角弓反张肿头、冠和肉髯紫黑色血斑、跖部鳞片出血、饮水量减少。

分为3种即急性型、呼吸道型、野禽的隐性型感染。

2.2病理变化高致的病变一般就是坏死，主要的就是消化器官为主；有的病性直接就会破坏泌尿生殖道，不是致病的病情就会不影响病理的变化。

2.3诊断方法及程序2.3.1 流行病学禽流感病毒的宿主广泛,鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。

一般鸡和火鸡都是对病毒禽流感最严重危害的，然而鸭子体内的病毒就比其他的禽类多很多。

2.3.2 临床症状禽流感的潜伏期一般都是从几个小时到3d都是不一定的，有的时候时间的长短都是看感染病毒的毒力和剂量、感染的一些途径、还有就是感染禽的种别和禽体得一些状态。

3 稀释液的配制一定使用PH7.2的PBS液，摄氏121度灭菌15分钟，冷却后，摄氏4度恒温保存备用。

灭菌的时间和温度及恒温保存是关键要素，不能随意改变。

也可先配制浓缩的PBS液保存，每次使用时稀释。

禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原与阴、阳性血清使用说明书【主要成分与含量】抗原为灭活的H5亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log2。

阳性血清为SPF鸡感染禽流感病H5亚型制备的高免血清，HI效价≥7log2。

阴性血清为SPF鸡血清。

【性状】抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。

易于与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

【作用与用途】用于HI试验检测禽流感病毒H5亚型抗体。

【用法与测定】1、材料1.1 96孔V型（90°）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。

1.2 PH值7.2 0.01mol/L PBS1.2.1 配制25倍PB 称量2.74 Na2HPO4和0.79gNaH2PO4·H2O,，加蒸馏水至1000m1;1.2.2 配制1倍PBS 量取40m1 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000m1;1.2.3 用Na0H或HCL调pH值至7.2;1.2.4 69Kpa15min高压灭菌或用微孔滤膜过滤除菌。

1.2.5 PBS一经使用，于2-8℃保存不超过3周。

1.3 阿氏(Aisevers)液称葡萄糖2.5g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0. O55g、氯化钠0.42g,加蒸馏水至1OOm来ml，加热溶解后调pH值至6.1， 69Kpa 15min 高压灭菌，2-8℃保存备用。

1.4 1%鸡红细胞悬液采集采集2-3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH值7.2 0.Olmol/L PBS液洗涤3次，每次均以3000rpm/mi n离心5min，洗涤后用PBS配成1% (V/V)红细胞悬液，2-8℃保存备用。

（采5ml鸡血，分置3管，添加盐水6ml，多一点也没关系，充分用吸管反复吹打混均，放置在离心机离心，把上清液去掉，反复3次。

）1.5 抗原溶解冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。

标准操作规程（SOP）——一、目的本SOP为了规范红细胞凝集试验（HA，hemagglutination test）操作，确保试验的质量而制定。

二、范围适用于中国国家流感中心所有技术人员进行流感/禽流感病毒红细胞凝集试验。

三、程序（一）生物安全要求季节性流感病毒或经完全灭活的高致病禽流感病毒和H2N2流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，操作人员采取BSL-2级防护。

禽流感H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行，操作人员采取BSL-3级防护。

具体防护参见“生物安全个人防护SOP”。

（二）材料1．待测毒株2．1%红细胞悬液（鸡、豚鼠，由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该类病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞）3．磷酸缓冲液（PBS），0.01M， pH 7.4 (Sigma P 3813)4．多道及单道可调加样器单通道可调加样器量程为20μL～200μL、200μL～1000μL8通道或12道可调加样器量程为20μL～200μL5．96孔微量板：鸡红细胞选择“V”型或“U”型底微量板；豚鼠红细胞选择“U”型底微量板。

6．其它耗材，200μL、1000μL滴头、试管、加样槽等。

（三）实验步骤1．进入实验室前做好个人防护。

2．试验前试剂准备：（1）PBS配制：按照Sigma的说明书的要求配制PBS缓冲液。

121℃高压灭菌20min，分装，4℃储存。

（2）1%红细胞悬液：按照“1%鸡红细胞悬液配制SOP、1%豚鼠红细胞悬液配制SOP”配制红细胞悬液。

3．根据所用的红细胞种类选用适当的微量板.。

将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～A12称为A 行。

标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。

4．加PBS，取8道加样器装好200μL带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μL PBS 加入微量板的第二列，依次加入50μL PBS直至最后一列。

1、原理禽流感病毒表面的血凝素能豚鼠和鸡的红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞凝集。

2 适用范围主要用于检测禽流感免疫动物血清抗体效价。

3 试验器材和试剂3.1 96孔110°V型血凝板3.2 微量移液器（50μL 25μL）带塑咀3.3 微量振荡器3.4 禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型阳性血清。

3.5 1%鸡红细胞悬液3.6 PH7.2 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）4 HA试验方法4.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。

4.2吸取0.025mL病毒悬液加入第l孔，混匀。

4.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。

4.4每孔再加入0.025mL PBS。

4.5每孔均加入0.025mL 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。

4.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。

对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。

4.7结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。

价，此效价为1个血凝单位（HAU）。

注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。

5 HI试验方法5.1 根据4的试验结果配制4HAU的病毒抗原。

以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。

例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。

5.2 在微量反应板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。

5.3 吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。

5.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。