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测黄曲霉毒素方法：一．（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul(2)色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)533 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5: 125: 5: 125 (ng/ml)602 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5: 10: 2.5 (ng/ml)603（二）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.5ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)544 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25: 1:0.25 (ng/ml)545色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25: 1:0.25 (ng/ml) cromasil150柱604（三）（1）色谱条件色谱柱：依利特C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.3ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)594 (四)（1）色谱条件（到此方法时，荧光灯的灯能量快不行了。
峰面积也受影响了。
）色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)534 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25:1:0.25 (ng/ml)535 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10:2.5:10:2.5 (ng/ml)598（五）（1）色谱条件（从这一步开始，换了新的荧光灯）色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.6ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5:10:2.5 (ng/ml)611（六）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.5ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5: 1.25:5:1.25. (ng/ml)608 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5:10:2.5(ng/ml) cromasil150柱609（七）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.3ml/min进样量：20ul(2)色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25:1:0.25 (ng/ml).597（八）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：水（45:55）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5:1.25:5:1.25 (ng/ml)538 陈皮样品色谱图（一）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56））荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.6ml/min进样量：20ul（2）陈皮色谱图2个重复616617（二）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：水（45:55）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长455nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）陈皮色谱图541（十）分析结果一览表结论：药典中关于黄曲霉毒素的测定法，步骤比较简单。
普瑞邦PriboFast® KRC 光化学柱后衍生反应器PriboFast®KRC光化学柱后衍生反应器广泛应用于液相色谱检测分析, 使用时置于色谱柱和检测器之间，进行柱后连续光化学衍生反应提高荧光、紫外、电化学检测和化学发光检测器的灵敏度和响应的选择性。
采取液相色谱-荧光法检测黄曲霉毒素时，使用光化学衍生器进行柱后衍生,不需要任何化学试剂, 能有效增强黄曲霉毒素B1和G1的荧光强度，黄曲霉毒素B1和G1灵敏度能够达到0.1ppb以上；1、运行环境：温度5℃～40℃；相对湿度≤85%；适用电压220V（±10%），50Hz(±2%)2、技术参数2.1与HPLC-荧光检测器配套使用在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生，不需要任何化学试剂2.2黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限低于0.1ppb.2.3符合15版中国药典，AOAC 2005.08, AOCS Aa 11-05和欧盟药典 2.8.18标准分析方法。
3、配置要求3.1 KRC柱后衍生光化学反应池(还包括10米透明质化线圈，254 纳米灯管，抛光反应池架，电源控制器）1套3.2塑料漏斗(10 个/包)1包3.3玻璃微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）1盒3.4一次性测试管（250个/包）1包3.4 Peek 两通(客户自备)4、技术资料3.1提供仪器设备的中文安装操作说明书。
3.2提供仪器设备的英文说明书。
3.3 仪器设备须经中国政府批准在中国境内销售，适合中国国家标准，或通用国际标准。
3.4 仪器设备的保修期为一年。
在保修期内，供货厂商在接到用户要求对所购仪器设备进行维修时，应在24小时之内给予答复以及后续维修服务。
5、技术特点:1. 在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生，重现性好；不需要任何化学衍生试剂，减少了液相系统的清洗工作，延长了其使用寿命。
2．黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限在0.1ppb以下。
中药材中黄曲霉毒素的污染及快速定量检测方案--8min准确定量一、黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素是一类真菌(黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物，具有很强的致癌性，它们主要存在于药材、谷物、坚果、棉籽以及动物饲料相关的产品中。
毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，且以B1毒性最大。
当人摄入量大时，会发生急性中毒，急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。
当微量持续摄入时，会造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。
二、黄曲霉毒素检测的中药材品种及其国家限量标准2010版《中国药典》规定黄曲霉素检查的5种药材：酸枣仁、僵蚕、胖大海、陈皮、桃仁。
现行的2015版《中国药典》规定黄曲霉毒素检查的19种中药材，相对2010版《中国药典》增加了14个品种：(1)根及根茎类：远志；(2)果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁；(3)动物类：水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕。
黄曲霉毒素类别限量标准（μg/kg）黄曲霉毒素B1 ≤5黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1及≤10黄曲霉毒素G2总量引自：现行的2015版《中国药典》《中国药典》对黄曲霉毒素检测的要求，既突出了中药整体质量控制的特点，又增加和完善了安全性控制方面的要求。
三、上海飞测生物中药材中黄曲霉毒素B1快速定量检测方案--8min准确定量检测原理：4.1.黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测系统性能◆检测灵敏度：0.5μg/kg；◆定量线性范围：1.0μg/kg - 75.0μg/kg；◆样品前处理时间：7min；◆检测时间：8min；◆准确度：回收率为80%-125%；◆特异性：在1000μg/kg浓度水平下与其它真菌毒素无交叉反应；4.2.样品前处理过程1、粉碎（中药材样品粉碎处理、称量）；2、振荡提取（5min）；3、离心（2min）；4.3.检测操作过程1、稀释；2、加样反应（8min）；3、读数，打印检测报告；4.4.结果判读和输出采用便携式黄曲霉毒素B1检测仪进行读数，使得检测结果更加准确、客观，避免人为的误判。
柱后衍生—HPLC测定与分析沉香中黄曲霉毒素目的：对沉香中黄曲霉毒素进行测定。
方法：采用柱后衍生-HPLC联用技术，测定沉香中黄曲霉毒素的含量，了解所获沉香中黄曲霉毒素污染情况。
结果：按照《中国药典》2015版的要求与指导原则，69批次沉香样品均未检出黄曲霉毒素。
结论：柱后衍生-HPLC联用技术测定沉香中黄曲霉毒素方法可行，我国沉香黄曲霉毒素未受到黄曲霉毒素污染。
标签：沉香；黄曲霉；柱后衍生-HPLC黄曲霉毒素是真菌毒素中毒性最强的一种真菌毒素，具有极强的毒性和致癌性。
在自然界中，无论是土壤、腐烂有机质物品与植物纤维、农产品或者其他食品上都有黄曲霉毒素存在。
黄曲霉最适宜生存在相对湿度85%左右的热带、亚热带地区并产生黄曲霉毒素。
我国地域十分辽阔以及气候的多样性和复杂性导致我国中药材和中药饮片在加工、贮藏、运输的过程中，很容易发生霉变而导致被黄曲霉毒素污染。
因此，检测中药材中黄曲霉毒素具有极其重要的意义[1-4]。
目前2015版《中国药典》仅仅对少数几种中药材规定有关黄曲霉毒素含量的限度标准，如陈皮，胖大海等。
沉香是我国的名贵中药材之一，2016年广东省通过立法保护广东八种道地中药材，沉香为其中之一。
由于沉香主产越南、海南和广东等热带和亚热带地区，该地区的环境条件极易被黄曲霉等真菌类污染而产生黄曲霉毒素。
因此，笔者拟采用柱后衍生与高效液相色谱联用技术[5-8]，通过对沉香进行黄曲霉毒素测定，建立沉香中黄曲霉毒素含量测定的方法，为监管部门提供技术支持。
1仪器与材料11仪器Waters 2695/2475高效液相色谱仪及柱后衍生系统；色谱柱：Shim-pack CLC-ODS C18（150mm×6mm，5μm）、phenomenex gemini C18（250mm×46mm，5μm）、Thermo ODS-2 HYERSIL（200mm×46mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×46mm，5μm）；离心机：Thermo Scientific Multifuge X1R 12材料黄曲霉素混合对照品（批号：46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2纯度分别为990%、990%、997%、995% ，Supelco Analitical）。
黄曲霉毒素测定法第一法本法系用高效液相色谱法（附录8）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，采用柱后衍生法检测，①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②以光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm （或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度1100转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱（AflaT-est@P）,流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
2351 黄曲霉毒素测定法
第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。
当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水
(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。
混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素
B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于
均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 分别精密吸取上述混合对照品溶液 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色
谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
另精密吸取上述 供试品溶液 20~25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄 曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 的量，计算，即得。
【附注】 (1)本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
(2)残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器(装有 10％次氯酸 钠溶液)内，浸泡 24 小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
1
2010 年版药典第二增补本修订该法，增加光化学衍生法。
第二法2 本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素，除另有规 定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃，以甲醇
为流动相 A 相，以 10mmol/L 醋酸铵水溶液为流动相 B 相，流速 0.3ml/min；按下表进行梯 度洗脱： 流动相梯度
时间/min 0 4.5 6 6.5 10 A 相/% 65 15 0 65 65 B 相/% 35 85 100 35 35
以三重四极杆质谱仪作为检测器，电化学喷雾离子源，采集模式为正离子模式，各化合 物质谱参数见下表： 黄曲霉毒素测定质谱参数表
名称 黄曲霉毒素 G2 黄曲霉毒素 G1 黄曲霉毒素 B2 黄曲霉毒素 B1
去簇电压 定量离子 （DP：伏） 55 60 55 60 331.1/313.1 329.1/243.1 315.0/259.1 313.1/241.0 （CE：伏） 33 35 35 50 碰撞能量 定性离子 1 331.1/245.1 329.1/311.1 315.0/287.1 313.1/285.0 碰撞能量 （CE：伏） 40 30 40 40
混合对照品溶液的制备
精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素 B1、黄曲
黄曲霉毒素 G1、 黄曲霉毒素 G2 的标示浓度分别为 1.0μg/ml、 0.3μg/ml、 1.0μg/ml、 霉毒素 B2、 0.3μg/ml、 ）适量，用 70％甲醇稀释成含黄曲霉毒素 B2、G2 浓度为 0.04～3ng/ml，含黄曲霉 毒素 B1、G1 0.12～10ng/ml 的系列对照品溶液，即得（测定时可根据样品实际情况，制备混 合对照品溶液或基质混合对照品溶液） 。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g（过二号筛） ，精密称定，置于均质杯中，加
入氯化钠 3g，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟（搅拌速度大于 11000 转／分 钟） ，离心 5 分钟（离心速度 2500 转／分钟） ，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用 水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液 20ml，通过免疫亲合柱， 流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适 量甲醇洗脱，收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2
增订第二法。
测定法
精密吸取上述混合对照品溶液各 5µl，注入液相色谱－质谱仪，测定峰面积，
以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。
另精密吸取上述供试品溶液 5μl， 注入液相色谱－质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中黄曲霉毒素 B1、黄曲霉 毒素 B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 的浓度，计算，即得。
。
