当前位置：文档之家 › 基因敲除方法专题-郭..55页PPT

基因敲除方法专题-郭..55页PPT

  • 格式：ppt
  • 大小：4.45 MB
  • 文档页数：55

下载文档原格式

  / 55

合集下载

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
33
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
24
（二）
25
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性

分子生物学课件：基因敲除

分子生物学课件：基因敲除
P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123

基因敲除,RNA 干扰,MirPPT55页

基因敲除,RNA 干扰,MirPPT55页
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
基因敲除, 干扰,Mir
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克

博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT

博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT

靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。

条件性基因敲除与敲入ppt课件

条件性基因敲除与敲入ppt课件
行杂交。
构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相
似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核
显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
20
先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的 方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输 卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下：
3
经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。

《基因敲除技术》PPT课件

《基因敲除技术》PPT课件
16
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
23
2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂

分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件

4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性

基因敲除ppt课件


LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体，获得相应的转基因 小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点 间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
（1）在胚胎干细胞（ES ）中通过置换型载体进 行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因， 并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突 变，同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因，含有HSV - tk (胸苷 激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而 杀死细胞。
外源 基因
整合到染色体 的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等，因而可以 应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA， 导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用，也可以看作是 基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
（2）显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”，此 转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。 （3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。
此外，还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’

基因敲除方法专题-郭..


• 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研 究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首 次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义 RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫， 却能高效、特异地阻断相应基因的表达 。实际上每个细胞只要 很少几个分子的双链在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他 们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 • 并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实 是转录时污染微量dsRNA所造成的。
反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，
siRNA）。
r
RNAi过程的功能单元：siRNA
• siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端
均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ核酸酶
称为Dicer。
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
四、RNAi研究的一般技术路线
目的基因mRNA序列分析 设计siRNA序列 正义RNA和反义RNA的合成 构建转基因载体 转入受体细胞 检测基因抑制结果
存在的问题

目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移 入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为 siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不 清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的 研究报道不多。 siRNA的稳定性 在多基因家族中的非特异性问题 如何将RNAi技术运用到临床试验

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件


.
5
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
.
11
.
12
.
13
Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
.
1
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
• 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互 补的RNA分子。
• 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：
• Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列(ShineDalgarno sequence）和(或)部分编码区，直接抑制 翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 Ⅲ 降解
• 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异 性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制 mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方 式，最早是在 E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真 核生物中也存在反义RNA。
反义RNA技术
差异性状---基于已知序列---高通量表达差异分析---确定大量关 联基因---新基因---价格昂贵---数据分析处理复杂
图位克隆
群体至关重要---工作量超大ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ--获得基因随机---仍是王道
Ø图位克隆策略
寻找性状差异 或突变体
选择父母本 杂交-F1 自交 构建群体 表型统计
差异显著（最好其他性状差异较小） 不分离 性状分离 单粒传
➢ 然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象 。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链
孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的
类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验 中这种共抑制现象被称为“quelling”现象。
What’s more...
• 2019年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues尝试用反义RNA (antisense RNA)去阻断秀丽新小
优点：简单，短平快 局限：过于简单，技术含量低，非新基因，文章水平相对较低
后续试验内容需增加
Ø蛋白差异分析： 性状差异---双向电泳---蛋白点分离---氨基酸组成分析---序列 端部分析---DNA信息
差异蛋白点过多，测序片段随机且过短，氨基酸→碱基序列简并 性过高
Ø高通量基因芯片（诺丁汉大学—陆春贵博士）：
RNAi技术被《Science》杂志评为2019年的十大科学进展之 一，并名列2019年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可 以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛 用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域 。 2019年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello） 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基 因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中 序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替 受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整 合入受体细胞的基因组中，达到定点修饰或改造 染色体上某一基因的目的。
Ø 基因敲除的方法
u同源重组敲除技术 u条件性基因敲除法 u诱导性基因敲除法 u锌指核酸酶(ZFNs)技术 uRNA干扰技术 uTALEN技术 uCRISPR-Cas9技术
分子标记
SSR等
软件分析初步定位
回交-扩大群体 近等基因系
精细定位 1-5cM甚至更小 基因组探针筛选 目标基因连锁的分子标记 叠连克隆群 染色体步移
外显子的分离、鉴定
确定基因 功能互补实验
转基因过表达、基因敲除
基因敲除专题
Ø 基因敲除概述 基因敲除(knockout)是一种遗传工程基因修
饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定 的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研 究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而 推测该基因的生物学功能。
我们不再大海捞针！！！
RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高 度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱 发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是真核生物中存在 的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。
一、RNAi的发现简史
➢ 90年代初，Rich Jorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行 研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启 子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多 数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制现象(cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都 被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。