病毒滴度的测定

病毒滴度的测定

 病毒感染的测量方法

– 直接计数法

 将病毒与乳胶颗粒混合,电子显微镜观测

 缺点是无法判断病毒的感染性

– 间接计数法

 空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)

 50%终点法

 血凝试验

 干扰滴定

第一节 空斑形成单位法

一、基本原理

 原理

– 空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)试验：

 将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒

感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗

粒引起，计数空斑数目再乘稀释倍数，得病毒感染的浓度

– 病毒空斑—蚀斑

 将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中，吸附1h后，覆盖营养琼脂

 病毒在琼脂中只感染临近的细胞，形成空斑的退化细胞区

 中性红染色：活细胞染红色；死细胞无色

 产生CPU的病毒均可用此方法

二、方法与步骤

 测定病毒空斑的试验方法

– 病毒杀死感染细胞的检测：产生细胞病变效应  中型红：活细胞染红色

 台盼兰：死细胞染蓝色

 MTT：溴化二苯基四氮唑，将活细胞染成深蓝色，易于计数，易

分离病毒转化或有抵抗力的细胞

– 未能杀死细胞可产生血凝素

 因能吸附红细胞，空斑用血吸附显出

 用显微镜计数吸附红细胞的空斑

– 细胞融合：

 病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞，用显微镜观

查合胞体空斑

– 空斑中含有病毒的抗原

 免疫荧光分析

– 免疫组化技术

 生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术

 间接免疫过氧化物酶染色

三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算

 空斑形成单位试验技术

– 传代细胞平皿法

 单层细胞浓度为2×106，培养液为RPMI1640，Eagle，MEM

 病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释，每个稀释度培养2瓶，每加一次

样时要新吸管，来回吸三次，加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾

斜来回摇动，使病毒均匀

 CO2孵箱吸附90min后，再用营养琼脂覆盖  培养5~8d后，加入0.01%的中性红染色，计数空斑

 病毒滴度的计数

– 按以下公式计算

空斑形成单位(PFUs/ml) = dvnn21

X1、X2、Xn：表示同一稀释度在不同培养孔板（实验单位）中数得到的空斑数；n表示计

数空斑的培养板孔数；v表示病毒量（ml）；d表示稀释倍数 例：以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞，四个培养板孔中的空斑数分别为1，1，3及5个，

接种量为0.2 ml

空斑形成单位(PFUs/ml) = 4100.245311 = 1.25×105PFUs/ml

 空斑形成单位（PFUs）与重复感染数（M.O.I）

– 重复感染数（Mutiplicity of Infection，M.O.I）是指感染一个

细胞的病毒颗粒的平均数

– 一般来说， M.O.I值越大，则实验细胞被感染的比例越大

– 若某病毒的PFUs 已经测得，要按一定量的M.0.I进行感染细

胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算

公式1：实验细胞数×所需的M.O.I值=所需的PFUs

公式2：所需的PFUs/实际病毒的PFUs=需要加的病毒量

例：已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml，试验细胞数为每孔1.8

×106，计划M.O.I值为200。

解答按公式1得到所需的PFUs= 1.8×106 ×200=3.6 ×108；

按公式2得到所需的病毒量= 3.6 ×108/1.3 ×1011=2.8μl

四、注意事项

 对细胞的要求

– 严格，单层细胞一定要均匀，形态和状态良好

 对病毒的要求

– 对热敏感的病毒在冰浴中进行稀释

– 每一稀释度换一只吸管

 对培养基的要求

– 避光培养防止中性红见光分解对细胞有毒作用

 对观察计数的要求

– 当空斑数目达到稳定

– 中性红时间应在空斑出现前在暗处培养 – 生长较慢的病毒，中性红应加在培养几天后的最后一层覆盖

第二节 50%终点法测定病毒滴度

一、基本原理

 原理

– 50%终点（50% endpoint）法

将病毒液稀释后接种至动物、鸡胚或细胞层，将每个稀释度造成的动

物、鸡胚致死量或细胞病变做成曲线，找出造成50%动物或鸡胚

死亡或细胞病变的终点稀释度

LD50（50% Lethal dose）—50%动物或鸡胚致死的病毒含量

ID50（50% Infectious dose）—50%动物或鸡胚感染剂量

CCID50（50% cell culture infectious dose）—50%细胞培养产生病

变效应的剂量

二、方法与步骤

 细胞病变效应的情况

– 细胞形态完全发生改变

 胞核及整个细胞发生肿胀，胞浆颗粒样变化

 细胞发生皱缩、变圆、脱落

 多见于很多病毒如肠道病毒、痘病毒、呼肠病毒等

– 细胞聚合：如腺病毒

– 细胞融合成合胞体：有多核，如疱疹病毒

– 产生轻微病变：如正粘病毒、狂犬病毒、逆转录病毒

 方法与步骤

– 制备细胞

 细胞的浓度约为20万~30万/ml,置微量细胞培养板

– 孵育细胞

 5%CO2孵箱 – 接种病毒

 病毒用含Eagle’s液作10倍递增稀释

 每稀释度加4孔,每孔100μl

 设立细胞对照孔

 结果观察:

– 细胞病变程度表示法

 -：表示无细胞病变；+：表示1%~25%的细胞病变；++：表示

26%~50%的细胞病变；+++：表示51%~75%的细胞病变；++++：

表示76%~100%的细胞病变；

– 结果记录

 CCID50（半数细胞培养感染剂量）-凡能使50%细胞出现病变的最

高稀释度

 TCID50—半数组织培养感染剂量

三、50%终点法的计算

 CCID50的计算

– Reed-Muench法

– 据该病毒的CCID50介于10-4（3/4）和10-5（2/4）

距离比例 = ㏒稀释倍数数低于50％的感染百分—数高于50％的感染百分50％—数高于50％的感染百分 =

767.0㏒1040835083——

lgCCID50=高于50%的感染百分数的低稀释度的对数+距离比例

=-4+（-0.767）=-4.767

即此病毒按1：63000按0.1ml接种细胞后，可使50%的细胞病变

– Karber法

– 公式： lgCCID50=L+d（S-0.5）

 L-病毒的最低稀释倍数的对数  d-稀释系数；

 s-细胞病变比值的和（不包括最低比值）

– CCID50与PFUs的换算

 预计的PFUs等于0.7乘以CCID50

第三节 血凝试验和感染滴定

一、血凝试验的基本原理

 血凝原理

– 血凝现象

 血凝抑制试验

 干扰滴定原理

– 干扰现象

 两种病毒同时感染同一细胞发，发生一种病毒抑制另一病毒增殖

 先进的感染后进的；死的干扰活的

– 方法：是将不产生CPE的病毒（感染病毒）先感染细胞，培养

一定时间后再用相应的能产生CPE的病毒感染同一细胞，如果

抑制能产生CPE的病毒的增殖即为阳性孔，计数再用Karber

法测定

病毒溶液的滴度的描述方法

滴度测定方法包括2类：物理方法（VP）

1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）：测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm

处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病

毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。

生物学方法（GTU、PFU、TCID50）

2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）：

GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ

等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。 3． PFU（空斑形成单位） ：PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细

胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技

术员操作也很少能得到相同的结果。

4． TCID50（50%组织培养感染剂量）： TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但

以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个

体间也更稳定。 所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会

影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进

行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。

对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表-6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗

粒/2个颗粒。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：

106~107 第一代细胞经冻融后 108~109 100倍数量的细胞经过冻融后

1010~1011 用氯化铯方法纯化后

表6：各滴度测定方法特性

方法 类型 时间 可重复性 滴度* 评注

VP 物理学方法 2小时 好 5×1012

GTU 生物学方法 2天 可变 2×1011

PFU 生物学方法 21天 变化很大 5×1010 传统方法

TCID50 生物学方法 10天 可变 2.5×1011 昆腾公司标准方法

以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准： O.D.260 nm（VP/ml）法

这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1×1012/ OD260 单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如

果 OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含

缺陷性颗粒。

1． 4℃融化病毒保存液。

2． 在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4，

1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。

最小需要量为： s

病毒裂解液 病毒 稀释度 52ul 52ul 1：2（稀释液1）

168ul 42ul 1：5（稀释液2） 注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD