病毒中和试验测定法

禽流感病毒中和实验及其他方法

（一）实验材料

1、中和反应实验材料

(1)病毒：

一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50）的滴定。

(2)血清样品

包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。－20℃储存，避免多次反复冻融。

(3)MDCK细胞和细胞培养试剂

1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）

2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌

500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）

5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）

5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔）

25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清

3)胰酶 / EDTA

(4)其它 1)平底96孔微量培养板

2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。

429毫升 DMEM

66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA）

5毫升 100×抗生素

3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升）

4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存

400毫升 丙酮

100毫升 PBS，PH 7.2

2、ELISA实验材料

(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体

(2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG

(3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20

4升 PBS，PH 7.2

2毫升 TWEEN－20

(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20

867毫升PBS，PH 7.2

132毫升牛血清白蛋白

1毫升TWEEN－20 (5)底物和底物溶液：

中和试验

物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：

1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。

3.分析病毒的抗原性。

毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。

用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。

(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)

1.病毒毒价的测定 毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量

中和试验

中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。

所属分类：免疫学

概述

动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。

中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

两种试验方法介绍

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。

(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)

1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量 (EID50)。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。

(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10、10、10……10，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。

表2-24LD50的计算（接种剂量为0.03ml）

RSV特异性中和抗体滴度检测

一、实验原理：

抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。）

二、实验分类：

1. 固定血清--稀释病毒中和试验

2. 固定病毒—稀释血清中和试验

3. 简单定性中和试验

4. 空斑减少法

三、实验步骤：

1. 提前设定56 ℃水浴锅，将分装好的待测血清于56 ℃灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。

2. 将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37℃预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。

3. 实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210µl，再加相应的血清30µl），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75µl的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75µl，用排枪以两倍梯度稀释血清。（注意：最终到256倍时吸出的多余的75µl血清并弃掉。） 4. 实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25 µl（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104 TCID50 病毒混匀，4℃孵育2 h。

5. 在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37℃的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。经过计数和相应的稀释后使得细胞浓度为105个/ml 。最后加入104个Hep-2细胞（或1.5*104个Vreo 细胞）100 µl，将细胞铺好后于37 ℃的 CO2无菌培养箱培养。