一、实验目的
了解谷丙转氨酶在生物体内的作用及其在临床诊断中的意义，学习谷丙转氨酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶（ALT）是一种广泛存在于生物体内的酶，主要存在于肝脏、心脏等组织中。它催化丙氨酸与α-酮戊二酸在氨基转移过程中相互转化，生成谷氨酸和丙酮酸。在正常情况下，血清中的ALT含量较低。当肝细胞受损时，ALT会从细胞内释放到血液中，导致血清ALT活性升高。因此，血清ALT活性的测定在临床诊断中具有重要意义。
本实验采用比色法测定血清ALT活性，通过观察反应体系中丙酮酸与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙（2，4-DNP-P）的生成量，来计算酶的活力。
三、实验材料与仪器
1. 材料：
- 血清样本
- 2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）
- α-酮戊二酸
- 丙氨酸
- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）
- 磷酸二氢钠（NaH2PO4）
- 0.1mol/L氢氧化钠（NaOH）
- 0.1mol/L盐酸（HCl）
- 标准曲线样品
2. 仪器：
- 酶标仪
- 移液器 - 恒温水浴锅
- 移液管
- 试管
四、实验步骤
1. 标准曲线的制作：
- 配制不同浓度的标准曲线样品，分别加入丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。
- 将标准曲线样品置于酶标仪中，在特定波长下测定吸光度。
- 以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 血清ALT活性的测定：
- 将血清样本按照一定比例加入反应体系中，加入2，4-DNPH和底物，混匀。
- 将反应体系置于恒温水浴锅中，反应一定时间。
- 反应结束后，加入0.1mol/L氢氧化钠终止反应。
- 将终止后的反应体系置于酶标仪中，在特定波长下测定吸光度。
- 根据标准曲线，计算血清ALT活性。
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货号: QS1900 规格：50管/24样
谷丙转氨酶（GPT）活性测定试剂盒说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GPT（EC 2.6.1.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化氨基酸和酮酸转氨基反应，在氨基酸代谢中具有重要作用。此外，哺乳动物肝细胞GPT活性很高，当肝细胞坏死，GPT释放到血液中，血清GPT活性显著增高。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
测定原理：
GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在碱性条件下呈红棕色，可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：液体5 mL×1瓶， 4℃避光保存；
试剂三：液体50 mL×1瓶，4℃保存；
样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清谷丙转氨酶的测定实验报告
血清谷丙转氨酶的测定实验报告
引言：
血清谷丙转氨酶（AST）是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，主要参与氨基酸代谢过程。AST的测定在临床上具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。本实验旨在通过酶促动力学方法测定血清中AST的活性，并分析实验结果。
实验材料与方法：
1. 实验材料：
- 血清标本：从健康志愿者采集的血样。
- AST测定试剂盒：包括底物、辅酶、酶标试剂等。
- 酶标仪：用于测定底物的光吸收值。
2. 实验方法：
- 步骤一：标定酶标仪
将已知浓度的AST酶标溶液分别加入不同的试管中，测定其对应的光吸收值，建立标准曲线。
- 步骤二：制备样本
将采集到的血清标本离心，取上清液，稀释至适宜浓度。
- 步骤三：测定AST活性
将标定好的试剂和稀释后的血清标本加入试管中，混匀后，放入酶标仪中测定吸光度。
- 步骤四：计算AST活性 根据标准曲线，计算出各个样本的AST活性。
结果与讨论：
通过实验测定，我们得到了一系列样本的AST活性数据。根据标准曲线，我们可以计算出每个样本的AST活性，并进行进一步的分析。
首先，我们可以观察到不同样本之间AST活性的差异。正常情况下，AST活性在一个相对稳定的范围内，超出该范围可能提示肝脏功能异常或疾病存在。因此，通过测定AST活性，我们可以初步判断一个人的肝脏健康状况。
其次，我们还可以对不同条件下AST活性的变化进行研究。例如，我们可以比较不同性别、不同年龄段、不同体重指数的人群的AST活性是否存在差异。这样的研究有助于进一步了解AST在人体内的生理变化和代谢过程。
此外，我们还可以将AST活性与其他临床指标进行关联分析。例如，我们可以比较AST活性与肝功能指标、炎症指标等之间的关系。这些关联分析可以为临床诊断和治疗提供重要的参考依据。
实验十三 氨基移换反应——谷丙转氨酶活性的测定（纸层析法）
一、目的
进一步理解转氨基作用。
学习应用纸层析法鉴定氨基移换反应。
二、原理
转氨基作用是指在转氨酶的催化下α-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移作用。转氨酶广泛存在于
生物体内，目前已发现的转氨酶至少有50种以上，其辅酶均为磷酸吡哆醛，酶反应的最适pH为7.4。
生物体内分布最广、活力最强的转氨酶有两种：一种为谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶，
GPT）主要存在于肝脏；另一种为谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶，GOT）在心肌中活力
最大，其次在肝脏。
丙氨酸酮戊二酸丙酮酸谷氨酸+−⎯⎯→⎯+αGPT
天冬氨酸酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸+−⎯⎯→⎯+αGOT
正常情况下转氨酶主要存在于细胞中，人及动物的血清中含量很少，活性很低。而当组织细胞
受到损伤（如发生肝炎、心肌梗死等病变）时，这些细胞中的转氨酶就会释放到血液中去，此时血
清中转氨酶的含量及活性均显著增加。因此转氨酶活性的测定在临床诊断上有重要意义。
三、仪器、试剂与材料
剪刀、镊子、研钵、大烧杯、试管及试管架、吸量管、漏斗、滤纸、培养皿、表面皿、酒精灯、
喷雾器、恒温水浴箱、烘箱、离心机。
1%谷氨酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.1%碳酸氢钾溶液、0.025%溴乙酸溶液、2%醋酸溶液、0.9%
氯化钠溶液、标准谷氨酸溶液、标准丙氨酸溶液、酚饱和水溶液（扩展剂）、0.1%水合茚三酮正丁醇
溶液（显色剂）。
兔肝、海砂。
四、操作
1、 肝匀浆液制备
在研钵中加入兔肝1g＋0.9%氯化钠3ml＋海砂200mg→置于放有冰水的大烧杯上面，研磨成匀
浆→3000r/min离心5min→弃沉淀、得到肝糜匀浆液。
2、 氨基移换反应：
取干燥试管2支，分别标明测定管与对照管。 实验管1 对照管2
1%谷氨酸溶液（ml） 0.5 0.5 1%丙酮酸钠溶液（ml） 0.5 0.5
0.1%碳酸氢钾（ml） 0.5 0.5
