一、实验目的
了解谷丙转氨酶在生物体内的作用及其在临床诊断中的意义，学习谷丙转氨酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶（ALT）是一种广泛存在于生物体内的酶，主要存在于肝脏、心脏等组织中。它催化丙氨酸与α-酮戊二酸在氨基转移过程中相互转化，生成谷氨酸和丙酮酸。在正常情况下，血清中的ALT含量较低。当肝细胞受损时，ALT会从细胞内释放到血液中，导致血清ALT活性升高。因此，血清ALT活性的测定在临床诊断中具有重要意义。
本实验采用比色法测定血清ALT活性，通过观察反应体系中丙酮酸与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙（2，4-DNP-P）的生成量，来计算酶的活力。
三、实验材料与仪器
1. 材料：
- 血清样本
- 2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）
- α-酮戊二酸
- 丙氨酸
- 磷酸氢二钠（Na2HPO4）
- 磷酸二氢钠（NaH2PO4）
- 0.1mol/L氢氧化钠（NaOH）
- 0.1mol/L盐酸（HCl）
- 标准曲线样品
2. 仪器：
- 酶标仪
- 移液器 - 恒温水浴锅
- 移液管
- 试管
四、实验步骤
1. 标准曲线的制作：
- 配制不同浓度的标准曲线样品，分别加入丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。
- 将标准曲线样品置于酶标仪中，在特定波长下测定吸光度。
- 以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 血清ALT活性的测定：
- 将血清样本按照一定比例加入反应体系中，加入2，4-DNPH和底物，混匀。
- 将反应体系置于恒温水浴锅中，反应一定时间。
- 反应结束后，加入0.1mol/L氢氧化钠终止反应。
- 将终止后的反应体系置于酶标仪中，在特定波长下测定吸光度。
- 根据标准曲线，计算血清ALT活性。
实验十三 氨基移换反应——谷丙转氨酶活性的测定（纸层析法）
一、目的
进一步理解转氨基作用。
学习应用纸层析法鉴定氨基移换反应。
二、原理
转氨基作用是指在转氨酶的催化下α-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移作用。转氨酶广泛存在于
生物体内，目前已发现的转氨酶至少有50种以上，其辅酶均为磷酸吡哆醛，酶反应的最适pH为7.4。
生物体内分布最广、活力最强的转氨酶有两种：一种为谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶，
GPT）主要存在于肝脏；另一种为谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶，GOT）在心肌中活力
最大，其次在肝脏。
丙氨酸酮戊二酸丙酮酸谷氨酸+−⎯⎯→⎯+αGPT
天冬氨酸酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸+−⎯⎯→⎯+αGOT
正常情况下转氨酶主要存在于细胞中，人及动物的血清中含量很少，活性很低。而当组织细胞
受到损伤（如发生肝炎、心肌梗死等病变）时，这些细胞中的转氨酶就会释放到血液中去，此时血
清中转氨酶的含量及活性均显著增加。因此转氨酶活性的测定在临床诊断上有重要意义。
三、仪器、试剂与材料
剪刀、镊子、研钵、大烧杯、试管及试管架、吸量管、漏斗、滤纸、培养皿、表面皿、酒精灯、
喷雾器、恒温水浴箱、烘箱、离心机。
1%谷氨酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.1%碳酸氢钾溶液、0.025%溴乙酸溶液、2%醋酸溶液、0.9%
氯化钠溶液、标准谷氨酸溶液、标准丙氨酸溶液、酚饱和水溶液（扩展剂）、0.1%水合茚三酮正丁醇
溶液（显色剂）。
兔肝、海砂。
四、操作
1、 肝匀浆液制备
在研钵中加入兔肝1g＋0.9%氯化钠3ml＋海砂200mg→置于放有冰水的大烧杯上面，研磨成匀
浆→3000r/min离心5min→弃沉淀、得到肝糜匀浆液。
2、 氨基移换反应：
取干燥试管2支，分别标明测定管与对照管。 实验管1 对照管2
1%谷氨酸溶液（ml） 0.5 0.5 1%丙酮酸钠溶液（ml） 0.5 0.5
0.1%碳酸氢钾（ml） 0.5 0.5
实验八 肝脏谷丙转氨酶活力测定
实验类型：验证性实验
相关知识
1. 酶活力：
2. 酶活力单位(即酶含量的多少)
国际单位
习惯单位：谷丙转氨酶在37度与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位
3.转氨酶
4 谷丙转氨酶
一、 实验目的
1． 了解转氨酶的性质及临床意义
2． 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法
二、实验原理
丙氨酸及α－酮戊二酸作用为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。
丙酮酸能与2,4－二硝基苯肼结合，生成丙酸－2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于测定丙酮酸的含量。
α－酮戊二酸也能与2,4－二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸－2,4二硝基苯腙的吸光度有差别，在520nm波长比色时，丙酸－2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。
在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α－酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以测定谷丙转氨酶的活力。
三、实验器材、试剂、材料
1． 新鲜猪猪脏
2． 722型分光光度计、剪刀、吸管
3． 标准丙酮酸溶液；谷丙转氨酶底物；0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）；0.02%2,4－二硝基苯肼；0.4mol/L NaOH溶液 2 ＋
辅基为磷2 2 + + ‘ ‘ 四、实验操作步聚
1. 肝匀浆制备
（1） 将猪肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内（或小研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆。（每四组1份）
（2） 吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）（每四组1份）
2. 谷丙转氨酶活力测定 （每组做1份）
实验九 血清谷丙转氨酶的测定
一、实验目的
1．掌握比色分析法测定血清谷丙转氨酶活性的原理；
2．熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的方法；
3．了解血清谷丙转氨酶测定的临床意义。
二、原理
血清谷丙转氨酶（Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｔ）作用于丙氨酸及α－酮戊二酸，结果生成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2，4－二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。
GPT
α－酮戊二酸＋丙氨酸
谷氨酸＋丙酮酸
丙酮酸＋２.４－二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯腙
(红棕色)
三、操作
15×25mm中试管4支，标号，按下表操作：
管号
试剂（ml） 标 准 管 标准空白管 测 定 管 测定空白管
丙酮酸标准液（100μg/ml） 0.1 — — —
新 鲜 血 清 — — 0.1 0.1
底物液（在37℃保温过） 0.5 0.5 0.5 —
磷酸盐缓冲液 — 0.1 — —
前 三 管 置 于 37℃ 保 温 30 分 钟
2.4二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5
底 物 液 — — — 0.5
充 分 混 合，置 于 37℃ 保 温 20 分 钟
0.4N 氢氧化钠 5.0 5.0 .0 5.0
静止10分钟后，选用520nm的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。
四、计算 本法所规定的谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml血清于37℃与底物作用30分钟，产生2.5μg丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。
测定管光密度－测定空白管光密度 1 1
血清谷丙转氨酶= × 10 × ×
