Western Blot 原理和操作方法(全)

Western Blot 原理和操作方法（全）Western Blot工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ?SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×105 10-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5③分离胶:电泳凝胶浓度试剂10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.51.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.1510%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6总体积(ml) 10 15④浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.510%SDS(μl) 80 4010%AP(μl) 60 30TEMED(μl) 8 4总体积(ml) 6 3蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。

它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。

二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。

-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。

-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。

2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。

-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。

-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。

3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。

-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。

-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。

-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。

-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。

三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。

-完全溶解样品，可加热至95°C处理。

2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。

-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。

-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。

3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。

-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。

WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。

它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。

本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。

一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。

具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。

2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。

这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。

3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。

4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。

5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。

6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。

7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。

8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。

9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。

二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。

1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。

b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。

c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。

2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。

b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。

c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。

3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。

westernblot原理及步骤一、配胶原理：30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细）10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。

与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。

同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。

每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上）2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml）10%方案如下：H2O 4.0ml30% acrylamide mix 3.3ml1.5M Tris(ph 8.8)2.5ml10% SDS 0.1ml10% ammonium persulfate 0.1mlTEMED 0.004ml3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。

不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了）4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满5、等待20分钟6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml30% acrylamide mix 0.67ml1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml10% SDS 0.04ml10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，等待20min二、测定蛋白浓度原理：A液是质量浓度为0.1g/mL氢氧化钠溶液（20ul protein assayS+1ml protein assay A），B液是质量浓度为0.01g/mL硫酸铜溶液。

westernblot原理及步骤Western blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体, 然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western blot 应用：目的蛋白的表达特性分析；目的蛋白与其他蛋白的互作；目的蛋白的组织定位；目的蛋白的表达量分析；蛋白样品的制备：1水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；2有机溶剂提取法；3离心管柱提取法：超快速,易用,高产及重复性强；4通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。

Western blot注意事顶和常见问题：1我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度,同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

2我做的蛋白质分子量很小(10 KD ),请问怎么做WB ?答：可以选择0.2 pm的膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

3最后显色时用DAB好还是ECM好？答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物;ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级蛋白，具体可以根据你实验的情况。

4要验证某个细胞上有无该蛋白的存在■需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量,而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

5细胞水平要做western blot r多少细胞提的蛋白够做western blot ?答：一般5x106就足够了。

westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。

当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。

通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。

这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。

2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。

蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。

SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。

电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。

封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。

抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。

蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。

Western blot的原理1.western blot即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

具体可看westernblot 原理3.步骤（一）蛋白样品制备培养的细胞（定性）1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。

3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。

4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。

若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

7.待样品恢复到室温后上样。

培养的细胞（定量）1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。

4.12000g离心，4℃，2min。

5.取少量上清进行定量。

6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。

方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。

5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。

Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。

WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。