DNA操作的基本工具

DNA重组技术的基本工具DNA重组技术是一种重要的分子生物学技术，用于改变基因组中的DNA序列，使之具有特定的功能。

这项技术的应用范围广泛，可以在基础研究、医学诊断、药物开发等领域发挥重要作用。

DNA重组技术的基本工具包括DNA片段的制备、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒和载体等。

首先，DNA片段的制备是DNA重组技术的第一步。

通过PCR（聚合酶链反应）或限制性内切酶切割，可以从某个DNA源中获取特定的DNA片段。

PCR是一种体外扩增技术，可以将特定的DNA序列进行快速放大。

限制性内切酶是一类特殊的酶，可以识别特定的DNA序列并在该序列上切割DNA链。

通过PCR和限制性内切酶的组合应用，可以制备出需要的DNA片段。

其次，限制性内切酶是DNA重组技术中的重要工具之一。

限制性内切酶可以特异性地切割DNA链，并产生一定的粘性或平滑的DNA末端。

这些末端的特性决定了DNA片段连接的方式。

常用的限制性内切酶有EcoRI、BamHI、HindIII等。

当两个DNA片段具有相同的限制性内切酶切割位点时，它们可以通过限制性内切酶的连接来形成一个新的DNA分子。

接下来，DNA连接酶也是DNA重组技术中必不可少的工具之一。

DNA连接酶能够将两个DNA片段在适当的条件下连接在一起。

常用的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和DNA聚合酶。

通过合适的实验条件和适当的连接酶，可以使两个DNA片段有效地连接成为一个整体。

此外，质粒和载体也是DNA重组技术中的重要工具。

质粒是一种小环状DNA分子，在细菌细胞中存在，并能自我复制。

载体则是质粒或其他DNA分子，用于携带所需的DNA片段。

通过将需要插入的DNA片段连接到载体上的限制性内切酶切割位点上，并将该载体转化至宿主细胞中，就可以实现外源DNA的导入。

在实际应用中，DNA重组技术的基本工具往往是共同配合使用的。

通过PCR或限制性内切酶的组合，可以制备出所需的DNA片段；通过限制性内切酶的连接和DNA连接酶的应用，可以将不同的DNA片段连接起来形成一个新的DNA分子；通过质粒和载体的应用，可以将需要插入的DNA片段导入到宿主细胞中实现转化。

《DNA 重组技术的基本工具》讲义DNA 重组技术，也被称为基因工程，是现代生物技术的核心之一。

它让我们能够在分子水平上对生物的遗传物质进行操作和改造，为人类带来了许多前所未有的机遇和可能性。

而要实现 DNA 重组，就离不开一系列的基本工具，下面我们就来详细了解一下这些工具。

一、限制性内切酶限制性内切酶，简称限制酶，是 DNA 重组技术中最重要的工具之一。

它就像是一把极其精准的“分子剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。

限制酶具有高度的特异性，每种限制酶只能识别和切割特定的DNA 序列。

这些特定的序列通常被称为识别序列或识别位点，它们具有回文结构，即从两条链的 5'端向 3'端读取，序列是相同的。

例如，EcoRⅠ限制酶识别的序列是 5'GAATTC-3'，切割位点在 G和 A 之间。

当限制酶作用于 DNA 分子时，会产生两种类型的末端：黏性末端和平末端。

黏性末端是指被限制酶切割后，产生的两条链的末端具有互补的单链突出部分。

这种末端很容易通过碱基互补配对重新连接起来，这在DNA 重组中非常重要。

平末端则是指切割后产生的两条链的末端是平齐的，相对来说，连接起来的难度稍大一些。

限制酶的发现和应用，为 DNA 重组技术的发展奠定了基础。

通过使用不同的限制酶，可以将不同来源的 DNA 片段切割成具有相同末端的片段，从而为后续的连接创造条件。

二、DNA 连接酶有了限制酶把 DNA 分子切割开，还需要有“胶水”把它们粘起来，这就是 DNA 连接酶的作用。

DNA 连接酶能够将两个具有互补黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。

在连接过程中，DNA 连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，从而实现 DNA 片段的连接。

常见的 DNA 连接酶有两种：T4 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。

T4 DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，但连接平末端的效率相对较低；大肠杆菌 DNA 连接酶则只能连接黏性末端。

生物重组DNA技术是利用基因工程方法对DNA分子进行重新组合和修改的技术。

下面是生物重组DNA技术中常用的基本工具：限制性内切酶（Restriction Enzymes）：这些酶能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子。

限制性内切酶可以用于切割目标DNA和载体DNA，以便进行重组。

DNA连接酶（DNA Ligase）：这种酶能够将两条DNA分子的断裂末端连接在一起，形成一个完整的DNA分子。

DNA连接酶用于将目标DNA片段与载体DNA片段连接起来，构建重组DNA。

DNA聚合酶（DNA Polymerase）：DNA聚合酶能够在DNA模板上合成新的DNA链。

在重组DNA技术中，DNA聚合酶可用于扩增目标DNA片段，进行PCR（聚合酶链式反应）等操作。

电泳装置（Electrophoresis Apparatus）：电泳装置用于将DNA分子按照大小进行分离和纯化。

通过电泳，可以根据目标DNA的大小和电荷特性对其进行分离和检测。

载体（Vector）：载体是用于携带和复制重组DNA的DNA分子，如质粒或病毒。

载体提供了重组DNA在细胞中复制和表达的环境。

转化（Transformation）：转化是将重组DNA导入目标细胞中的过程。

通过转化，重组DNA 可以被细胞摄取并稳定地存在于细胞内。

DNA测序技术（DNA Sequencing）：DNA测序技术用于确定DNA分子的核酸序列。

它是生物重组DNA技术中重要的工具，可用于验证重组DNA的正确性和准确性。

这些基本工具在生物重组DNA技术中起着关键的作用，使研究人员能够对DNA进行精确的操作和修改，从而实现基因的克隆、重组和表达。

第1节重组DNA技术的基本工具学案设计(一)学习目标1.掌握基因工程操作的三种工具(限制酶、DNA 连接酶、载体)。

2.能够准确说出每一种操作工具的特点及用途。

自主预习一、基因工程的概念1.操作场所:生物体外。

2.操作技术:等技术。

3.操作结果:赋予生物新的,创造出更符合人们需要的新的和。

4.操作水平:水平。

二、重组DNA技术的基本工具1.限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”(1)来源:主要来自。

(2)功能:能够识别双链DNA分子的特定,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。

(3)大多数限制酶的识别序列由个核苷酸组成,切割的结果是产生末端。

2.DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。

(2)3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)常用载体:,它是一种裸露的、结构简单、独立于之外,具有能力的分子。

(2)质粒适于用作基因载体的特点Ⅰ.质粒分子上有一个至多个位点,供外源DNA片段插入其中。

Ⅱ.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,能在细胞中进行,或上,随受体DNA同步复制。

Ⅲ.质粒上常有特殊的,便于的筛选。

(3)基因工程中使用的载体除质粒外,还有等。

课堂探究课堂探究一:1.已知限制酶Eco R Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G ↓AATTC 和CCC ↓GGG,在图中写出两种限制酶切割DNA 后产生的末端并写出末端的种类。

Eco R Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列 (填“相同”或“不同”),切割位点(填“相同”或“不同”),说明限制酶具有 性。

2.为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来?推测它在原核生物中的作用是什么?它会不会切割自己的DNA 分子?课堂探究二:1.3.限制性内切核酸酶和DNA 连接酶的作用是否都体现了酶的专一性?课堂探究三:细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同?核心素养专练1.下列有关基因工程的叙述,错误的是()A.基因工程产生的变异属于基因突变B.最常用的载体是质粒C.工具酶主要有限制性内切核酸酶和DNA连接酶D.该技术人为地增加了生物变异的范围,实现了物种间遗传物质的交换2.在基因工程操作过程中,DNA连接酶的作用是()A.将任意两个DNA片段连接起来B.将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来,包括DNA片段和碱基对之间的氢键C.连接具有相同黏性末端或平末端的DNA片段,即形成磷酸二酯键D.只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键3.下列有关质粒的叙述,正确的是()A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.质粒是真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,能自我复制的环状双链DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后,才能在宿主细胞内复制D.基因工程中常用的载体除了质粒外,还有核DNA、动植物病毒以及噬菌体4.如图所示为限制酶Bam HⅠ、Eco RⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列,箭头表示每一种限制酶的特定切割位点,切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的限制酶及其正确的末端互补序列为()A.Bam HⅠ和Eco RⅠ;末端互补序列为—AATT—B.Bam HⅠ和HindⅢ;末端互补序列为—GATC—C.Eco RⅠ和HindⅢ;末端互补序列为—AATT—D.Bam HⅠ和BglⅡ;末端互补序列为—GATC—5.关于下图所示黏性末端的叙述,正确的是()①②③④A.①与③是由相同限制酶切割产生的B.DNA连接酶可催化①与③的连接C.经酶切形成④需要脱去2分子水D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端6.下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述,正确的是()A.用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口,有2个磷酸二酯键被断开B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大C.序列—CATG↓—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接7.某细菌质粒上有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。

《DNA 重组技术的基本工具》讲义在现代生物技术的领域中，DNA 重组技术无疑是一项具有划时代意义的伟大成就。

它为人类深入探究生命的奥秘、解决医学难题、推动农业发展等诸多方面提供了强有力的手段。

而要实现 DNA 重组，就离不开一系列的基本工具，这些工具如同巧匠手中的利器，帮助我们在微观的基因世界里实现精准操作。

一、限制性核酸内切酶（“分子手术刀”）限制性核酸内切酶是 DNA 重组技术中最为关键的工具之一。

它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。

不同的限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列是不同的。

这些识别序列通常具有回文结构，即从一条链的5’端到3’端读和从另一条链的3’端到5’端读，序列是相同的。

例如，EcoRⅠ识别的序列是5’GAATTC-3’，3’CTTAAG-5’。

限制性核酸内切酶切割 DNA 分子后，会产生两种类型的末端：黏性末端和平末端。

黏性末端是指在切割后，DNA 片段的末端有一段单链突出；平末端则是指切割后 DNA 片段的末端是平齐的。

限制性核酸内切酶的发现和应用，使得我们能够在特定的位置精确地切割 DNA 分子，为后续的 DNA 重组操作奠定了基础。

二、DNA 连接酶（“分子缝合针”）有了切割，自然就需要连接。

DNA 连接酶在 DNA 重组过程中扮演着“缝合针”的角色。

DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。

在连接过程中，它通过催化形成磷酸二酯键，将两个片段的末端连接在一起。

需要注意的是，DNA 连接酶并不能连接单链 DNA 分子，而且它对于具有不同末端的 DNA 片段连接效率较低。

三、载体（“分子运输车”）当我们获得了经过切割和连接处理的 DNA 片段后，还需要将它们运输到合适的细胞中进行表达和复制，这就需要载体发挥作用。

载体通常具有以下几个特点：1、能够在宿主细胞中稳定保存并自我复制，以便将携带的外源DNA 片段一起复制。

第1节重组DNA技术的基本工具[学习目标]阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。

一、基因工程的概念和工具酶1．基因工程的概念：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

概念剖析2．基因工程的工具酶(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”来源主要来自原核生物种类数千种作用识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开结果产生黏性末端或平末端(2)DNA连接酶——“分子缝合针”①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

②种类种类来源特点E.coli DNA连接酶大肠杆菌只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段T4 DNA 连接酶T4噬菌体既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低判断正误(1)通过基因工程产生的变异是不定向的()(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来()(4)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()(5)限制酶和解旋酶的作用部位相同()答案(1)×(2)×(3)×(4)×(5)×探讨点1基因工程的理论基础1．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？提示(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。

(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。

2．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？提示(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。

(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。

(3)生物界共用一套遗传密码。

探讨点2限制酶1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？提示不能。