吴茱萸不同炮制品对人正常肝细胞L02的体外肝毒性研究

吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的生长抑制及诱导凋亡作用朱丽红;刘小东;谭宇蕙;李杰芬;杜标炎;吴映雅【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2009(25)1【摘要】目的探讨吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的生长抑制、诱导凋亡和对细胞周期的影响.方法体外试验MIT法测存活率,DAPI染色观察细胞凋亡形态,流式细胞术、彗星电泳技术分析药物对DNA作用.结果吴茱萸碱能抑制人肝癌细胞ItepG2的生长.用64、16、4、1、0.25μmol·L-1浓度的吴茱萸碱处理HepG2细胞72 h的抑制率分别为74.0%、69.0%、60.5%、44.0%、16.4%.DAPI染色后吴茱萸碱组癌细胞均表现出较为典型的细胞凋亡特征.流式细胞仪检测1μmol·L-1吴茱萸碱作用24和36 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期阻滞于G2/M期.凋亡率对照组为4%,1 lunol·L-1吴茱萸碱作用12、24、36 h的凋亡率分别为4.4%、18.0%、30.3%.彗星电泳显示1μmol·L-1吴茱萸碱作用24和48 h后,细胞后面形成长的拖尾,平均光密度值较阴性对照组降低,彗星尾距较阴性对照组增加,且二者的改变与作用时间相关.结论吴茱萸碱能抑制人肝癌细胞HepG2的生长及诱导其凋亡.【总页数】4页(P68-71)【作者】朱丽红;刘小东;谭宇蕙;李杰芬;杜标炎;吴映雅【作者单位】广州中医药大学中医基础实验室,广东,广州,510405;广州中医药大学生化教研室,广东,广州,510405;广州中医药大学生化教研室,广东,广州,510405;广州中医药大学中医基础实验室,广东,广州,510405;广州中医药大学病理学教研室,广东,广州,510405;广州中医药大学生化教研室,广东,广州,510405【正文语种】中文【中图分类】R284.1;R329.25【相关文献】1.槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制及诱导凋亡作用 [J], 史桂兰;黄琳;卿海燕;陈琦2.p53在漆树黄酮诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的作用 [J], 李蓉;黎小兵;蔡康荣;陈锦;黄培春3.腺苷体外对人肝癌HepG2细胞凋亡的诱导作用及其作用机制 [J], 吴灵飞;苏剑东;李国平;蒲泽锦;冯家琳4.三萜皂苷Saxifragifolin D抑制人肝癌耐药细胞HepG2/ADM生长并诱导细胞凋亡作用研究 [J], 石俊敏;张冬梅;姚楠;冯国培;王英;栗原博;叶文才5.蒺藜皂苷对人肝癌细胞BEL7402生长抑制和诱导凋亡作用的研究 [J], 孙斌;瞿伟菁;张晓玲;杨煌建;庄秀园;章平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

吴茱萸的炮制方法及原理作用功效【常用别名】吴萸(《草木便方》)，左力(《南宁市药物志》)，米辣子(《中药材手册》)，吴芋、常吴萸(《中药志》)。

【来源】本品为芸香科植物吴茱萸Evodianutaecarpa(Juss.) Benth、石虎Evo dia ruta c-carpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Do de) Huang或疏毛吴茱萸Evodiarutaccarpa(Juss.)Benth.var.bodin ieri(Do de) Huang的干燥将近成熟果实。

【产地与产地加工】主产于贵州、湖南、广西、云南、陕西、浙江、四川等省区。

以湖南湘西，贵州铜仁产，为道地药材。

8~11月果实尚未开裂时，剪下果枝，晒干或低温干燥，除去枝、叶果梗，及杂质。

【历史尚革】汉代有洗法(《玉函》)，炒法(《金匮》)。

南北朝刘宋时代有盐水洗、醋煮法(《雷公》)。

唐代有酒煮法(《食疗》)。

宋代有炒焦(《圣惠方》)，醋炒(《博济》)，黑豆汤浸炒(《总录》)，童便浸法(《局方》)等。

明代有盐水炒，黄连水炒法(《入门》)。

清代有盐汤洗，焙干(《本草汇》)，糯米、萝卜煮法(《本草述》)等。

现行有甘草水制(《中国药典》1995年版)，盐制(《规范》)，炒制、甘草盐制、醋制、姜制(《汇典》)，酒制、黄连水制法(《云南》)等。

【炮制方法】净制除去杂质(《中国药典》1995年版)。

炮制1.甘草制取甘草捣碎，加适量水，煎汤去渣，加入净吴茱萸，闷润吸尽后，置热锅内文火翻炒至微干，取出，晒干。

每吴茱萸100kg，用甘草6kg(《中国药典》1995年版)。

2.盐制取净吴茱萸，于适宜容器内，加入盐水拌匀，置锅内用文火加热，炒至裂开，稍鼓起时，取出放凉。

每吴茱萸100kg，用食盐3kg(《规范》)。

3.炒制取吴茱萸，除去粗梗，筛去灰屑，用清炒法，炒至发泡，较原色稍深为度(《汇典》)c4.姜制取净吴茱萸，加生姜汁拌匀，炒干为度。

吴茱萸碱衍生物的设计合成及抗肝细胞癌活性研究吴茱萸碱衍生物的设计合成及抗肝细胞癌活性研究引言：肝细胞癌是一种常见的消化系统肿瘤，具有高度恶性和快速转移的特点，给人们的健康和生活带来了巨大的威胁。

基于目前化疗药物在治疗肝细胞癌方面的有限疗效和毒副作用，研究人员一直在寻求新的有效抗肿瘤药物。

吴茱萸碱作为一种天然产物，已被证明具有多种药理活性，包括抗肿瘤活性。

因此，设计合成吴茱萸碱衍生物并研究其抗肝细胞癌活性有着重要的理论和实际意义。

材料与方法：1. 吴茱萸碱衍生物的设计：通过结构修饰吴茱萸碱分子，引入新的基团，增强其生物活性。

2. 吴茱萸碱衍生物的合成：按照设计方案，通过一系列有机合成反应进行合成，并通过红外光谱、质谱等手段对合成产物进行鉴定。

结果与讨论：合成了吴茱萸碱的多个衍生物，并利用体外实验对吴茱萸碱衍生物的抗肝细胞癌活性进行了评价。

实验结果显示，与吴茱萸碱相比，吴茱萸碱衍生物在抗肝细胞癌活性方面表现出更好的效果。

其中的异丁基氯代吲哚吴茱萸碱衍生物示出最强的抑制作用，对肝细胞癌细胞的生长和增殖起到了明显的抑制作用。

结论：本研究成功设计并合成了一系列吴茱萸碱的衍生物，并对其抗肝细胞癌活性进行了评价。

实验结果显示吴茱萸碱衍生物对肝细胞癌细胞有更好的抑制效果，其中异丁基氯代吲哚吴茱萸碱衍生物表现出最强的抑制作用。

这些发现为开发新的有效抗肿瘤药物提供了重要的理论依据，同时也为吴茱萸碱的进一步研究和开发提供了新的思路。

展望：虽然本研究在吴茱萸碱衍生物的设计合成及抗肝细胞癌活性研究方面取得了一定的进展，但仍然存在一些问题和挑战。

下一步的研究可以深入探讨吴茱萸碱衍生物的作用机制，并考虑其在体内的药代动力学、毒性和副作用等方面的评价。

此外，还可以通过与其他已有抗肿瘤药物的联合应用，进一步提高其治疗效果，并为肝细胞癌的临床治疗提供更有力的支持。

结语：本研究以吴茱萸碱为基础，成功设计合成了多个吴茱萸碱的衍生物，并评价了其抗肝细胞癌活性。

不同方法炮制甘遂对LO2细胞周期与凋亡的影响作者：张丽高兰颜晓静曹雨诞丁安伟来源：《中国中药杂志》2013年第06期[摘要] 目的：探讨不同方法炮制所得甘遂各样品对人正常肝细胞LO2细胞周期与凋亡的影响。

方法：以人正常肝细胞LO2为研究对象，采用MTT法检测甘遂醋制前后各炮制品（生品、清炒品、醋润品、醋制品）对LO2细胞活性的影响，采用倒置显微镜观察细胞形态，采用流式细胞术研究甘遂醋制前后各炮制品对LO2细胞周期和凋亡的影响。

结果：与阴性对照组比较，甘遂生品可明显降低LO2细胞的活性（P2/M期细胞百分率（P醋润品>清炒品，且呈一定的量-效关系（r醋制=0.999， r醋润=0.913， r清炒=0.914， r生品=0.984）；且均能显著增加G2/M 期细胞百分率（P2/M期细胞百分率的顺序和降低凋亡率的顺序均为醋制品>醋润品>清炒品。

结论：甘遂炮制后可通过影响LO2细胞周期与凋亡降低其毒性，且甘遂醋制工艺中的炒与醋润2种操作在醋制降低甘遂的肝毒性中能够起到协同作用，从而为揭示上述2种操作在甘遂醋制减毒工艺中的合理性和醋制工艺优化提供了一定的依据。

[关键词] 甘遂；醋甘遂；炒；醋润；醋制；LO2细胞；减毒；细胞周期；细胞凋亡甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia kansui T.N. Liou ex T.P. Wang的块根[1]，始载于《神农本草经》，列为下品。

甘遂性味苦寒、有毒，具有泻水逐饮、破积通便功效，临床上广泛用于治疗术后粘连性肠梗阻[2]、重症急性胰腺炎[3]、肝硬化所致腹水[4]等。

但甘遂对口腔、胃肠道、眼、皮肤黏膜等具有严重的刺激性[5]，并有促发肿瘤[5]、致炎[6]、肝毒性[7]等副作用，严重制约该药的临床使用。

中医传统采用醋制法降低甘遂的毒性和刺激性，缓和其泻下作用[8]，其炮制工艺中包括加醋闷润和炒干2种操作，但对于醋润和炒干2种操作对醋制降低甘遂毒性作用的贡献和工艺的合理性，国内外迄今尚未见明确报道。

吴茱萸炮制，不一样的方法吴茱萸是常见的中药药材，在临床上有很多应用，治疗牙痛，湿疹，口疮，呕吐等症状，吴茱萸炮制的方法在古代和现代有一些差别，大家可以了解一些关于吴茱萸炮制的现代方法。

★ 1、古代炮制方法汉代有炒法(《玉函》)。

南北朝刘宋时代有盐制、醋制(《雷公》)。

唐代有姜汁制、酒制(《食疗》)，熬制(《外台》)等法。

宋代有炒令熟、炒令焦、醋制、焙制(《圣惠方》)，煨制(《博济》)，汤浸(《衍义》)，“水浸去涎炒”、醋浸炒、酒浸炒、黑豆制、汤浸去涎大豆同炒(《总录》)，酒醋童便复制(《局方》)，盐制(《总微》)，米醋熬(《三因》)，汤煮(《妇人》)，蒸制、童便浸(《朱氏》)等炮制方法。

元代有汤洗焙干(《脾胃论》)、酒洗焙(《宝鉴》)、盐炒(《丹溪》)等法。

明代有烫浸炒黄、醋浸炒黄、酒浸炒香熟、酒醋小便米泔或猪胞酒醋小便盐复制、火炮、酒醋制、破故纸炒(《普济方》)，水浸、黄连炒、牵牛子炒(《奇效》)，汤泡烘干(《蒙筌》)，煮制(《撮要》)，汤浸去苦汁盐水炒(《入门》)，滚盐汤泡去毒炒(《仁术》)，盐汤泡焙干(《必读》)，童便制(《景岳》)，炒黑(《济阴》)等方法。

清代有黄连制(《握灵》)、盐汤洗焙干(《本草汇》)、沸水泡(《崇原》)、盐炒童便煮(《说约》)、糯米煮制(《本草述》)、酒洗(《金鉴》)等炮制方法。

★ 2、现代炮制方法1、吴茱萸：取原药材，除去杂质及果柄、枝梗。

2、制吴茱萸：①取甘草片置锅内，加水(1:5)煎煮两次，去渣，加入净吴茱萸拌匀，闷润吸尽后，用文火加热，炒干，取出晾凉，吴茱萸每100kg用甘草6kg。

②取净吴茱萸，加盐水拌匀，稍闷，置炒制容器内，用文火加热，炒至裂开，稍鼓起时，取出晾凉，吴茱萸每100kg用食盐3kg。

③取净吴茱萸，置炒制容器内，用文火加热，炒至发泡，较原色稍深为度，取出晾凉。

3、临床应用1、生用(1)口疮：用本品研细，醋调外敷涌泉穴，24小时后取下，可引火下行，治虚火上炎之口舌生疮、高血压等。

∗基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:81400610);上海交通大学医工交叉研究基金资助项目(编号:YG2016MS72)作者单位:200092上海市上海交通大学医学院附属新华医院消化内科(吴伟杰,丁雯瑾,杨蕊旭,范建高);福建省立医院南院消化内镜中心(吴伟杰)第一作者:吴伟杰,男,27岁,硕士研究生㊂主要从事代谢相关脂肪性肝病的诊断与治疗学研究㊂E-mail:weijie_wu96@ 通讯作者:丁雯瑾,E-mail:dingwenjin@ ㊃实验性肝炎㊃Notch抑制剂DAPT体外改善L02细胞脂肪变研究∗吴伟杰,丁雯瑾,杨蕊旭,范建高㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨Notch抑制剂(DAPT)体外对脂肪变肝细胞细胞炎症因子及脂质相关基因水平的影响㊂方法㊀采用棕榈酸(PA)干预体外构建肝细胞脂肪变模型,采用不同浓度的DAPT干预㊂采用CCK-8检测细胞存活率,采用尼罗红染色了解细胞脂滴量,采用RT-qPCR法检测TNF-α㊁IL-1β和IL-6和脂肪相关因子ʌ固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP1c)㊁FASN和ACACAɔmRNA水平,采用Western blot法检测细胞p65和SREBP1c蛋白表达㊂结果㊀在无PA干预的L02细胞,经1μM㊁2μM㊁5μM和10μM DAPT处理细胞24h,细胞存活率均较对照组显著下降(分别为85.2ʃ5.3%㊁84.6ʃ2.9%㊁84.4ʃ6.0%和84.5ʃ3.2%对100.0%,P均<0.05);经2μM和5μM浓度的DAPT干预,细胞TNF-αmRNA水平分别为(0.6ʃ0.01)和(0.5ʃ0.1),显著低于对照组ʌ(1.0ʃ0.0),P<0.01ɔ,IL-1β水平分别为(0.7ʃ0.2)和(0.4ʃ0.0),显著低于对照组ʌ(1.1ʃ0.1),P<0.01ɔ,IL-6水平分别为(0.8ʃ0.1)和(0.6ʃ0.1),显著低于对照组ʌ(1.0ʃ0.0),P<0.05ɔ,细胞p65蛋白表达量也显著降低(P<0.05);2μM㊁5μM和10μM DAPT处理细胞脂滴荧光强度较对照组显著减弱ʌ分别为(0.2ʃ0.1)㊁(0.3ʃ0.0)和(0.1ʃ0.0)对(0.7ʃ0.0),P均<0.001ɔ,2μM和5μM DAPT处理细胞FASN mRNA水平分别为(0.7ʃ0.0)和(0.4ʃ0.1),显著低于对照组ʌ(1.0ʃ0.0),P<0.001ɔ㊁ACACA mRNA水平分别为(0.6ʃ0.1)和(0.3ʃ0.0),显著低于对照组ʌ(1.0ʃ0.0),P<0.001ɔ;5μM DAPT处理细胞SREBP1c蛋白表达量显著低于对照组(P<0.01)㊂结论㊀DAPT能有效降低体外脂肪变细胞炎症因子表达量,缓解细胞内脂滴形成,其机制可能与调控脂肪相关因子的表达有关,提示抑制Notch信号通路有改善细胞脂肪变发生和进展的潜力㊂㊀㊀ʌ关键词ɔ㊀L02细胞;脂肪变;Notch抑制剂;炎症因子;脂质;体外㊀㊀DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2024.01.005㊀㊀Notch inhibitor DAPT ameliorates steatosis of L02cells in vitro㊀Wu Weijie,Ding Wenjin,Yang Ruixu,et al.Department of Gastroenterology,Xinhua Hospital,JiaoTong University School of Medicine,Shanghai200092,China㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀The purpose of this experiment was to investigate the effects of Notch inhibitor(DAPT)on cellular inflammatory factors and lipid related genes in L02cells in vitro.Methods㊀The steatosis of L02cells was established by palmitic acid(PA)incubation in vitro,and also intervened by DAPT at0μM,1μM,2μM,5μM and10μM concentration.The cell survival rate was detected by CCK-8,the cell lipid droplets was observed by nile red staining,and the cellular TNF-α,IL-1βand IL-6mRNA and fat related factors[sterol regulatory element-binding protein1c(SREBP1c),FASN and ACACA]mRNA loads were detected by RT-qPCR.The cell p65and SREBP1c expression was detected by Western blot.Results㊀The cell survival rates of L02cell without PA intervention at1μM,2μM,5μM and10μM DAPT incubation for24h were all decreased compared to in the control(85.2ʃ5.3%,84.6ʃ2.9%,84.4ʃ6.0%and84.5ʃ3.2%vs.100.0%,respectively,P<0.05);in2μM and5μM DAPT-intervened cells,the TNF-αmRNA levels were(0.6ʃ0.01)and(0.5ʃ0.09),significantly lower than in the control [(1.0ʃ0.0),P<0.01],the IL-1βmRNA levels were(0.7ʃ0.2)and(0.4ʃ0.0),significantly lower than[(1.1ʃ0.1),P< 0.01]in the control,and the IL-6mRNA levels were(0.8ʃ0.1)and(0.6ʃ0.1),significantly lower than[(1.0ʃ0.0),P< 0.05]in the control group;the p65expression showed also remarkably decreased(P<0.05);the lipid droplets in2μM,5μM and10μM DAPT-intervened cells were significantly weaker than in the control group[(0.2ʃ0.1),(0.3ʃ0.0),(0.1ʃ0.0) vs.(0.73ʃ0.0),P<0.001],the FASN mRNA loads in2μM and5μM DAPT-intervened cells were(0.7ʃ0.0)and(0.4ʃ0.1),much lower than[(1.0ʃ0.0),P<0.001]in the control group,and the ACACA mRNA load in2μM and5μM DAPT-intervened cells were(0.6ʃ0.1)and(0.3ʃ0.0),much lower than[(1.0ʃ0.0),P<0.001]in the control group;the expression of SREBP1c protein at5μM and10μM DAPT-intervened cells was significantly weaker than in the control group(P<0.01).Conclusion㊀The DAPT could effectively inhibit theexpression of inflammatory factors and ameliorate the formation ofintracellular lipid droplets in L02cells with PA-induced steatosisin vitro,hinting the mechanism might be related to the regulationof fat-related factors.Our findings suggest that the inhibition ofNotch signal pathway might have a potential to alleviate theoccurrence and progression of cell steatosis.㊀㊀ʌKey wordsɔ㊀L02cells;Steatosis;Notch inhibitors;Inflammatory cytokines;Lipids;In vitro㊀㊀Notch信号通路是高度保守的单次跨膜信号受体蛋白家族,包括四个受体(Notch1/2/3/4)和五个配体(Jagged1㊁Jagged2㊁DLL1㊁DLL3和DLL4)及靶基因编码转录因子(Hes1和Hey1),涉及多种组织和器官早期发育所必需的细胞间调节,在细胞增殖㊁分化㊁凋亡等方面具有重要作用[1㊁2]㊂近几年,有研究报道Notch信号的活化参与肝脏再生与修复㊁炎症和纤维化过程[3]㊂此外,Notch基因异常表达会导致胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)㊁脂质异常和肥胖等多种代谢性疾病,它也能诱发非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发生[4,5]㊂我们之前的研究证实,无论是在蛋氨酸胆碱缺乏(methionine-choline deficient,MCD)小鼠模型还是棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导体内肝细胞脂肪变模型,均存在Notch基因家族的异常表达,并随代谢障碍相关脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated fatty liver disease,MAFLD)不同发展阶段而改变[6]㊂随后,我们应用Notch信号通路抑制剂(DAPT)体外处理脂肪变肝细胞,发现DAPT能抑制Notch下游Hes-1和Hey-1基因水平,同时能有效降低甘油三酯(triglyceride,TG)和转氨酶水平[7]㊂本研究在体外应用DAPT处理脂肪变的L02细胞,观察了抑制Notch家族后细胞炎症因子和脂质代谢相关基因水平变化㊂1　材料与方法1.1细胞㊁试剂与仪器㊀人正常肝细胞L02由中国科学院上海细胞库提供;RPMI-1640培养基和杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS)均购于美国Hyclone公司;胎牛血清(fatal bo-vine serum,FBS)购于以色列Biological Industries公司;γ分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alnyl]-S-phenylycine t-butyl ester(DAPT)和PA均购于美国默克公司;RPS -18内参引物购于中国上海生物工程公司;Trizol试剂和预混型定量用逆转录试剂盒均购于日本宝日医公司;qPCR SYBR Green Master Mix购于中国上海翊圣生物科技有限公司;CCK-8试剂盒㊁BCA蛋白浓度测定试剂盒㊁RIPA裂解液(强)和含DAPI的抗荧光淬灭封片剂均购于上海碧云天生物技术有限公司;尼罗红染料购于上海晶纯生化科技股份有限公司;抗GAPDH小鼠单克隆抗体购于美国Proteintech Group公司;抗固醇调节元件结合蛋白1c(sterol reg-ulatory element-binding protein1c,SREBP1c)小鼠单克隆抗体购于美国NOVUS公司;抗p65(NF-kappaB,NF-κB)兔单克隆抗体购于美国Abcam公司;ECL发光液购于美国Millipore公司;凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);Q3PCR扩增仪和Nano Drop 2000超微量分光光度仪(美国赛默飞公司);PCR逆转录仪(德国艾本德公司);Bio Tek Epoch全波长酶标仪(美国博腾仪器有限公司)㊂1.2体外细胞脂肪变模型的建立与DAPT干预㊀将5mM PA原液用RPMI-1640完全培养基(含10% FBS)稀释成含0.1mM㊁0.25mM和0.5mM PA的高脂培养基工作液㊁备用㊂取L02细胞,分为对照组(Con)㊁0.1mM PA组㊁0.25mM PA组和0.5mM PA组㊂待L02细胞融合度达到60%~70%时,弃培养基,用DPBS洗1遍,加入培养基或相应浓度的高脂培养基工作液处理L02细胞24h,收集细胞㊂根据前期实验结果确定0.25mM PA浓度作为体外细胞脂肪变的造模条件,分含或不含0.25mM PA处理细胞㊂采用0μM㊁1μM㊁2μM㊁5μM和10μM DAPT 处理细胞,其中0.25mM PA处理细胞在不加DAPT 处理组为模型组,处理L02细胞24h,收集细胞㊂1.3细胞存活率试验㊀使用CCK-8试剂盒进行细胞存活率测定㊂1.4细胞mRNA提取及水平检测㊀采用Trizol法提取细胞总RNA,逆转录后行实时荧光聚合酶链式反应(RT-qPCR),基因特异性引物序列为:SREBP1c-F:5 -CGGAACCATCTTGGCAACAGT-3 ; SREBP1c-R:5 -CGCTTCTCAATGGCGTTGT-3 ; FASN-F:5 -CCGAGACACTCGTGGGCTA-3 ; FASN-R:5 -CTTCAGCAGGACATTGATGCC-3 ; ACACA-F:5 -ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA-3 ; ACACA-R:5 -CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT-3 ;TNF-α-F:5 -CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3 ;TNF-α-R:5 -GAGGACCTGGGAGTAGATGAG -3 ;IL-1β-F:5 -AGCTACGAATCTCCGACCAC-3 ;IL-1β-R:5 -CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA -3 ;IL-6-F:5 -ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG -3 ;IL-6-R:5 -CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG -3 ㊂1.5细胞p65及SREBP1蛋白检测㊀采用Western blot法,用RIPA裂解法提取细胞总蛋白,经BCA试剂盒测定蛋白浓度,调节上样蛋白总量至相同㊂根据目的蛋白分子大小配制合适的SDS PAGE凝胶后开始上样㊁电泳㊁转膜,用5%脱脂牛奶封闭,按照抗体说明书相继加入一抗和二抗孵育后,经凝胶成像仪曝光成像,应用Image J软件对条带的灰度值进行定量分析㊂1.6细胞脂滴观察㊀在12孔细胞培养板,加入不同浓度的DAPT干预PA处理的L02细胞24h,弃培养基,用DPBS洗2遍,加入4%多聚甲醛固定15~30 min,用DPBS洗2遍㊂按照尼罗红原液:DPBS=1: 500的比例配制工作液,避光染色15min,弃去尼罗红染色工作液,用DPBS洗2遍㊂在每孔中加入含DAPI的抗荧光淬灭封片液100μL,置于荧光显微镜下观察㊂1.7统计学分析㊀应用GraphPad Prism8.0软件进行统计学分析和作图,计量资料以(xʃs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05被认为有统计学差异㊂2㊀结果2.1各组L02细胞存活率比较㊀在PA干预L02细胞8h㊁16h和24h,经CCK-8测定显示,L02细胞存活率随干预时间呈剂量依赖性下降趋势;与对照组细胞存活率为100%比,在干预8h㊁16h和24h 时,0.1mM㊁0.25mM和0.5mM PA干预L02细胞存活率均显著下降(P均<0.05,图1A);在无PA干预的L02细胞,经1μM㊁2μM㊁5μM和10μM DAPT 处理细胞24h,细胞存活率均较对照组显著下降(分别为85.2ʃ5.3%㊁84.6ʃ2.9%㊁84.4ʃ6.0%和84.5ʃ3.2%对100.0%,P均<0.05,图1B)㊂2.2不同浓度DAPT干预PA处理细胞相关细胞因子mRNA水平和p65蛋白表达变化㊀与模型(0μM DAPT处理)组比,各DAPT处理组TNF-α㊁IL-1β和IL-6mRNA水平均显著下调(P均<0.05,表1);与0μM DAPT处理组比,各DAPT处理组细胞p65蛋白均显著下调(P均<0.05,图2A㊁2B)㊂表1㊀不同浓度DAPT干预PA处理细胞相关细胞因子mRNA水平(xʃs)比较0μM1μM2μM5μM10μM TNF-α 1.0ʃ0.00.8ʃ0.10.6ʃ0.0③0.5ʃ0.1③0.4ʃ0.0③IL-β 1.1ʃ0.10.9ʃ0.10.7ʃ0.2②0.4ʃ0.0③0.4ʃ0.0③IL-6 1.0ʃ0.00.9ʃ0.10.8ʃ0.1①0.6ʃ0.1③0.6ʃ0.1③㊀㊀与模型组(0μM DAPT)比,①P<0.05;②P<0.01;③P<0.001图1㊀不同浓度PA和DAPT干预L02细胞存活率比较A:不同浓度的PA处理L02细胞;B:不同浓度的DAPT处理L02细胞24h;∗P<0.05图2㊀不同浓度DAPT干预PA处理细胞p65蛋白表达变化A:细胞p65蛋白表达(Western blot法);B:p65蛋白表达相对水平;∗P<0.05;∗∗P<0.012.3不同浓度DAPT干预PA处理细胞脂质代谢水平变化㊀与0μM DAPT组相比,各DAPT处理组细胞SREBP1c mRNA水平均无显著变化,在2μM㊁5μM和10μM DAPT处理组细胞FASN和ACACA mRNA水平均显著下降(P均<0.001,表2);在2μM㊁5μM和10μM DAPT处理组,细胞脂滴红色荧光强度较0μM DAPT组显著减弱[分别为(0.2ʃ0.1)㊁(0.3ʃ0.0)和(0.1ʃ0.0)对(0.7ʃ0.0),P均< 0.001,图3A);与0μM DAPT组相比,510μM和10μM DAPT处理组细胞SREBP1c蛋白水平均显著下调(P均<0.05,图3B和3C)㊂图3㊀不同浓度DAPT干预PA处理细胞脂质代谢变化A:细胞脂滴形成情况(尼罗红染色,400ˑ);B:细胞SREBP1c蛋白表达(Western blot法);C:细胞SREBP1c蛋白表达相对水平;∗P<0.05;∗∗P<0.01表2㊀不同浓度DAPT干预PA处理细胞脂质代谢相关基因mRNA水平(xʃs)比较0μM1μM2μM5μM10μM SREBP1c 1.1ʃ0.00.9ʃ0.10.9ʃ0.10.9ʃ0.10.9ʃ0.1 FASN 1.0ʃ0.00.9ʃ0.10.7ʃ0.0①0.4ʃ0.1①0.3ʃ0.0①ACACA 1.0ʃ0.00.9ʃ0.10.6ʃ0.1①0.3ʃ0.0①0.3ʃ0.1①㊀㊀与模型组(0μM DAPT)比,①P<0.053㊀讨论Notch基因的激活不仅与异常增殖㊁癌症疾病发生密切相关,也在细胞代谢过程中起着重要作用,其表达紊乱会导致多种代谢相关性疾病[8,9]㊂通常, MAFLD伴随代谢综合征的出现,目前普遍被认可的是 多次打击 学说,胰岛素抵抗㊁脂质过氧化㊁氧化应激等均参与其发病㊂在小鼠肝脏病理学研究发现,肝细胞特异性Notch功能丧失可缓解脂肪性肝炎相关肝纤维化,而增强Notch在肝细胞中的表达会通过上调Sox9依赖性骨桥蛋白,激活肝星状细胞并诱导肝脏纤维化[10]㊂也有研究使用Notch抑制剂可改善动物因高脂高糖饮食而导致的肝纤维化[11]㊂结合文献报道及我们团队先前的研究结果,有足够的证据表明Notch家族参与了MAFLD的发生和进展[6]㊂长期高脂饮食可以导致高脂血症㊁异位脂质沉积,过量的脂质沉积在肝细胞内而引起肝脏损伤,最后形成MAFLD[12]㊂有研究发现Notch在肝脏脂代谢过程中扮演重要角色㊂Notch1信号活化可以导致胰岛素抵抗加重,并与FOXO1协同增强葡萄糖-6-磷酸酶表达[13,14]㊂Notch信号可以激活mTOR信号通路,促使其下游SREBP1c表达,促进肝细胞脂肪生成㊂抑制Notch基因能通过降低mTOR的稳定性,弱化下游激酶核糖体蛋白S6激酶1活化,减缓SREBP1c依赖的脂肪从头合成,达到改善肝脂肪沉积的目的[15,16]㊂我们采用0.25mM PA浓度干预L02细胞24h成功构建体外细胞脂肪变模型,并可显著引起细胞内的脂质沉积和稳定激活Notch信号通路[7]㊂在体外肝细胞脂肪变细胞,以 不影响细胞活性 为基础,发现DAPT能缓解细胞炎症因子(TNF-α㊁IL-1β和IL-6)水平上升并下调p65蛋白表达,改善程度与DAPT浓度有一定的剂量依赖性㊂尼罗红染色可观察到细胞脂滴数量明显减少㊂TNF -α㊁IL-1β和IL-6与NF-κB核内易位活化密切相关㊂NF-κB信号通路激活可能是引起细胞内炎症反应的主要原因[17]㊂NF-κB的IKKα启动子序列与Notch信号下游转录因子Hes1存在部分重合,表明Notch信号可能从基因转录层面对炎症信号通路产生影响㊂因此,使用DAPT等Notch抑制剂或可抑制肝细胞内炎症反应和脂质沉积,具有防治MAFLD进展的潜力㊂作为γ-分泌酶底物的DAPT可以竞争性与γ分泌酶结合,从而实现间接抑制Notch信号转导[18]㊂在非酒精性脂肪性肝炎患者肝组织往往存在Notch 基因异常激活[19]㊂抑制Notch信号可改善糖尿病模型小鼠肝脏脂滴数量㊁降低血清肝酶水平并提高胰岛素敏感性,抑制Notch基因后可诱导AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和ACACA磷酸化,从而激活AMPK信号通路,促进脂肪酸氧化并抑制脂肪合成[20]㊂本研究我们进一步检测脂质代谢相关性基因SREBP1㊁FASN和ACACA 表达情况,经WB检测结果显示SREBP1c蛋白表达水平经过DAPT处理后明显下调,下游的FASN和ACACA脂肪合成相关基因mRNA水平也相应出现了下降㊂故DAPT可能通过降低SREBP1c蛋白的表达而抑制脂肪合成,从而具有调控脂质紊乱的作用㊂综上所述,应用DAPT抑制Notch基因家族可改善MALFD的炎症反应和脂质代谢异常㊂ʌ参考文献ɔ[1]Liubomirski Y,Ben-Baruch A.Notch-inflammation networks inregulation of breast cancer progression.Cells,2020,9(7):1576.[2]Liubomirski Y,Lerrer S,Meshel T,et al.Notch-mediated tumor-stroma-inflammation networks promote invasive properties and CXCL8expression in triple-negative breast Cancer.Front Immunol, 2019,10:804.[3]Chen W,Liu Y,Chen J,et al.The Notch signaling pathway regu-lates macrophage polarization in liver diseases.Int Immunopharma-col,2021,99:107938.[4]Zhou B,Lin W,Long Y,et al.Notch signaling pathway:architec-ture,disease,and therapeutics.Signal Transduct Target Ther, 2022,7(1):95.[5]Richter L R,Wan Q,Wen D,et al.Targeted delivery of Notch in-hibitor attenuates obesity-induced glucose intolerance and liver fi-brosis.ACS Nano,2020,14(6):6878-6886.[6]Ding WJ,Wu WJ,Chen YW,et al.Expression of Notch family isaltered in nonalcoholic fatty liver disease.Mol Med Rep,2020;22(3):1702-1708.[7]吴伟杰,陈源文,丁雯瑾,等.体外脂肪变L02细胞Notch家族和脂质代谢变化研究.实用肝脏病杂志,2021,24(5):653-656. [8]Adams J M,Jafar-Nejad H.The roles of Notch signaling in liverdevelopment and disease.Biomolecules,2019,9(10):608. [9]Xu H,Wang L.The role of Notch signaling pathway in non-alco-holic fatty liver disease.Front Mol Biosci,2021,8:792667. [10]Zhu C,Kim K,Wang X,et al.Hepatocyte Notch activationinduces liver fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis.Sci Transl Med, 2018,10(468):eaat0344.[11]Lee YA,Friedman SL.Inflammatory and fibrotic mechanisms inNAFLD-implications for new treatment strategies.J Intern Med, 2022,291(1):11-31.[12]Luna-Castillo KP,Olivares-Ochoa XC,Hernández-Ruiz RG,etal.The effect of dietary interventions on hypertriglyceridemia:from public health to molecular nutrition evidence.Nutrients,2022,14(5):1104.[13]Pajvani UB,Shawber CJ,Samuel VT,et al.Inhibition of Notchsignaling ameliorates insulin resistance in a Foxo1-dependent man-ner.Nat Med,2011,17(8):961-967.[14]Kitamoto T,Lee YK,Sultana N,et al.,Chemical induction of gutβ-like-cells by combined FoxO1/Notch inhibition as a glucose-lowering treatment for diabetes.Mol Metab,2022,66:101624. 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吴茱萸致肝毒性后大鼠体内样品的稳定性研究陈晨;孙向明;刘悦;高佳雪;李文兰【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(033)001【摘要】To investigate the stability of serum sample in rats with hepatic injury caused by Evodia rutaecarpa, the drug-containing serum samples without pretreatment and that treated with deproteinization method were stored at -20 °C for different time (0 d, 3 d, 5 d, 10 d and 15 d) , and then detected by HPLC -DAD, respectively.The stability of the serum sample was evaluated by comparing the RSD values of relative peak area of common peaks in each sample.Results indicated that all of the RSD values of common peak areas of prepro-cessed serum samples were less than 20%, and that of untreated samples were partly more than 30%.The serum samples treated with deproteinization method could be stored steadily at -20 °C for 15 d.However, the untreated serum samples are not stable at -20 °C within 15 d.%为了研究吴茱萸致肝毒性后大鼠血清样品的稳定性,采用HPLC-DAD技术,分别对-20℃冰箱中冷冻保存0、3、5、10、15 d未经前处理和经除蛋白处理后的含药血清样品进行色谱分析.通过比较各样品中共有峰相对峰面积的RSD值考察含药血清样品的稳定性.结果表明,经过除蛋白处理后的血清样品的共有峰相对峰面积的RSD值均小于20%;部分未经前处理的血清样品共有色谱峰相对峰面积的RSD值大于30%.含药血清样品经除蛋白和氮气吹干处理后,在-20℃至少可以稳定保存15 d;未经前处理的含药血清样品在-20℃存放存在不稳定问题.【总页数】4页(P4-7)【作者】陈晨;孙向明;刘悦;高佳雪;李文兰【作者单位】哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨150076;哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨150076;哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨150076;哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨150076;哈尔滨商业大学药学院,哈尔滨150076【正文语种】中文【中图分类】R285【相关文献】1.基于UPLC-Q-TOF MS的吴茱萸致肝毒性部位及入血成分分析 [J], 李文兰;孙向明;陈晨;刘悦;宋辉;丁晶鑫;徐蓓蕾;阎新佳2.吴茱萸挥发油多次给药致小鼠肝毒性氧化损伤机制研究 [J], 李晓宇;吴晓文;窦立雯;尹利顺;黄伟;孙蓉3.吴茱萸醇提物多次给药致大鼠肝毒性研究 [J], 孙向明;宋辉;丁晶鑫;徐昶儒;李文兰4.吴茱萸不同提取部位致大鼠肝毒性研究 [J], 任晓静; 李明; 张逊; 冯昊; 袁金斌5.吴茱萸致肝毒性部位在大鼠体内的多样性分析 [J], 孙向明;胡扬;温静;宋辉;李文兰;丁振铎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

吴茱萸不同组分镇痛作用及安全范围研究黄伟;孙蓉【期刊名称】《中国药物警戒》【年(卷),期】2012(009)007【摘要】Objective To research on the therapeutic index(TI) and the safety factor(SF) of different components of Evodia Fructus when playing analgestic effect. Methods To make research on the acute toxicity of different components in accordance with classical acute toxicity test methods; to make research on the analgestic effect of different components in accordance with the classical hot plate method; calculating the LD50, LD5, ED50 and ED95 using Bliss method, to calculate the TI and SF of analgestis effect of different components of Evodia Fructus. Results The LD50 of volatile oil in Evodia Fructus was 2.6995 mL·kg-1·-1, and the LD5 of volatile oil was 1.9853 mL·kg-1·d-1; the ED50 of volatile oil in Evodia Fructus was 0.4625 mL·kg-1·d-1, and the ED95 of volatile oil was 0.9996 mL·kg-1·d-1; TI was 5.837and SF was 1.986. The water extracts of-Evodia Fructus are unable to make LD50, MTD results calculated in accordance with crude drug content was 80.0 g·kg-1·d-1, the ED50 was 1.3515 g·kg-1·d-1, and the ED95 was 4.3435 g·kg-1 ·d-1. Conclusion Both the water extracts and volatile oil had certain analgestic effect and had certain dose—efficacy relationship, and the safety scope of water extracts was bigger than volatile oil.%目的研究吴茱萸不同组分发挥镇痛作用的治疗指数和安全范围.方法采用经典的急性毒性试验方法,进行吴茱萸不同组分的急性致死量试验；采用经典的小鼠热板法,进行吴茱萸不同组分的镇痛药效实验.采用Bliss 法,计算各组分的急性毒性试验的LD50和LD5以及发挥镇痛药效的ED50和ED95,求得不同组分发挥镇痛作用的治疗指数(TI),安全系数(SF).结果吴茱萸挥发油LD50值为2.6995 mL· kg-1·d-1,LD5值为1.9853 ml·kg-1·d-1;ED50值为0.4625mL·kg-1·d-1,ED95值为0.9996 mL· kg-1·d-1；计算得TI为5.837,SF为1.986.吴茱萸水提组分无法作出LD50,MTD试验结果按含生药量计算为80.0g·kg-1·d-1；ED50值为1.3515g·kg-1·d-1,ED95值为4.3435g·kg-1·d-1.结论吴茱萸水提组分和挥发油组分均有一定的镇痛作用,并呈现一定的量效关系,且吴茱萸水提组分发挥镇痛作用的安全范围大于挥发油组分.【总页数】4页(P397-400)【作者】黄伟;孙蓉【作者单位】山东省中医药研究院,山东济南250014;山东省中医药研究院,山东济南250014【正文语种】中文【中图分类】R282;R285.5【相关文献】1.吴茱萸化学拆分组分的性味药理学评价——化学拆分组分的制备及其镇痛作用的研究 [J], 杨志欣;孟永海;王秋红;杨炳友;匡海学2.艾叶不同组分发挥镇痛作用的安全范围研究 [J], 迟雪洁;王会;黄伟;鲍志烨;孙蓉3.北豆根不同组分发挥抗炎作用的安全范围研究 [J], 郑丽娜;罗栋;孙蓉4.香加皮不同组分发挥镇痛作用的安全范围研究 [J], 朱兰兰;鲍志烨;王会;黄伟;孙蓉5.山豆根不同组分发挥抗炎作用的安全范围研究 [J], 栾永福;罗栋;郑丽娜;谢元璋;孙蓉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。