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人凝血因子Ⅷ提取工艺优化研究邓志华;何淑琴;梁小明;张丽铃;黄璠【摘要】Objective Optimal human coagulation factor Ⅷ in plasma extracts process cond-itions. Methods With human plasma cryoprecipitate as raw materials,human factor VIII activity recovery rate as the evaluationindex,the single factor test was used to study the amount of alumina,the adsorption of pH value,pH value of acid precipitation,optimum extraction process. Re-sults Add cold precipitation of 12% alumina gel of 3% and the pH value is adjusted to 7.1,then adsorbed. The human factor Ⅷspecific activity ratio can reach 9.50IU/mg in the supernatant,acid precipitation when the pH value is adjusted to 6.3,human fac-torⅧspecific activity was 11.50 IU/mg in the centrifugal supernatant. Af-ter the above two steps,the human facto rⅧspecific ac-tivity increased nearly 2 times. Conclusion The optimization process is reasonable,feasible,could reach purification,extra-ction of human coagulation factorⅧ.%目的：优化血浆中人凝血因子Ⅷ提取工艺条件。
冻干人凝血因子Ⅷ浓制剂制造及检定规程本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鲜血浆分离、提纯、冻干并经病毒灭活制成。
主要成份为人凝血因子Ⅷ及少量纤维蛋白原，含适量枸橼酸钠，不含防腐剂。
本品对缺秒人凝血因子Ⅷ所致的凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。
1 制造1.1制造要求1.1.1 对血浆的要求1.1.1.1所用之血浆来源应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》要求，血浆应无凝块、无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。
在采集时应减少皮肤损伤，保持血流通畅，并与抗凝剂充分混合，用塑料袋采集。
新鲜分离液体血浆或新鲜冰冻血浆及冻结冷沉淀，均可用于生产。
1.1.1.2分离后的血浆应保持无菌，并应及时冰冻保存。
自采血到冻结一般在8小时内完成。
液体血浆应在4±2℃贮放，贮放时间应不超过小时，最长不得超过12小时。
冰冻血浆（-30℃以下）保存期不超过6个月。
1.1.2 对制造工作室、设备及原材料的要求，与《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.1.3～1.1.4项要求相同。
1.2 制造工艺1.2.1 采用低温乙醇法或冻融法制得冷沉淀，经抽提、吸附、精制，亦可采用经卫生部批准的其他工艺制备，并经卫生部批准的适宜方法进行病毒灭活处理。
1.2.2 分批同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批，不同滤器和不同机柜冻干的制品分为亚批。
1.2.3 稳定剂及防腐剂制品内允许加稳定剂，制品应不含防腐剂。
1.2.4除菌过滤及分装本品应用微孔薄膜过滤，可直接分装无菌的成品瓶内，每瓶装量根据效价及规格确定。
1.2.5 半成品检定每批半成品应进行效价测定及热原质试验，并按亚批做无菌试验。
1.2.6 冻干除菌过滤分装的制品经外观检查后立即冻结，并按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》1。
2。
5项规定进行冻干，但制品温度不得超过35℃。
1.3 规格每瓶含人凝血因子Ⅷ的效价可有50、100、200、300、400IU五种，制品的效价应标示在瓶签及包装上。
人凝血因子Ⅷ效价测定二步法1 材料1.1试剂1.1.10.05mol/L CaCl2溶液称7.35gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。
1.1.20.025mol/L CaCl2溶液称3.675gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。
1.1.3 咪唑缓冲液称0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于约100ml蒸馏水中，加37.2ml0.1mol/l HCl，加蒸馏水至200ml，pH为7.3～7.4。
1.1.4 枸橼酸盐-氯化钠溶液1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。
1.1.5Al(OH)3胶a称（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63℃蒸馏水中。
B称氨明矾19.175g，溶于250ml58℃的蒸馏水中。
C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸馏水。
三种溶液配毕后，立即将c液迅速倒入a液中搅匀，然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液，用力搅拌10分钟（保持温度不低于58℃），离心（2500r/min，15分钟），弃上清，沉淀洗涤5次。
第一次：用75ml蒸馏水加0.055ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。
第二次：用75ml蒸馏水加0.11ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。
第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。
将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中，混匀，分装，4℃保存。
1.1.6 正常人血清分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37℃保温5～6小时，置4℃冰箱过液，分离血清，混匀，定量分装（0.5ml/安瓿），冷冻干燥，-20℃保存。
缓冲液作1∶10稀释，4℃冰箱过夜（使血清活化），试验当日再用咪唑缓冲液作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。
1.1.7 牛Ⅴ因子收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中，室温放置4小时，离心（2500r/min，30分钟），分离血清，取血清加10%（g/ml）BaSO4在室温下搅拌吸附40分钟，离心（2500r/min，40分钟），弃沉淀，定量（1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。
八因子层析工艺立项建议-填料与层析柱07102007年10月关于八因子项目的层析工艺立项提案（社外秘）一、工艺路线借鉴国内外成熟的层析纯化工艺经验，结合自身的研究开发。
人血浆八因子的主要工艺技术路线（推荐）：1步层析工艺 + 2步病毒灭活（其他步骤略）说明：以下的提案内容仅涉及层析工艺部分的内容。
二、项目开发计划1、前期准备工作公司内部调研、公司外部调研、讨论该项目开发的必要性和可行性等2、提案与立项与供应商间进行交流、完成项目投资成本的初步估算；八因子项目的研发提案、公司高层的研究决策；八因子项目研发工作的正式立项3、小试阶段层析纯化介质、层析柱的选择；层析纯化条件的优化；层析纯化工艺的初步确立注：拟使用层析纯化介质为Toyopearl DEAE-650M（日本TOSOH公司产品）小试用预装柱柱尺寸：Toyopearl DEAE-650M PAK 22mmI.D.*20cmL （76mL·gel）4、中试阶段中试用层析柱的选择；层析纯化条件的进一步优化；（载量、纯度、回收率等指标的确认）批次重复/再现性试验；层析工艺的确立5、设备的引进、安装与调试层析纯化介质使用量的讨论、决定及购买；层析柱选用的讨论、决定及购买；安装调试等6、规模化试生产7、工艺验证（纯化工艺、病毒灭活工艺等）多方通力合作，完成八因子制备工艺的验证工作8、报批9、临床……三、项目投资成本的初步估算（层析工艺部分）（一）、层析纯化介质部分1、纯化介质的选用产品：Toyopearl DEAE-650M（日本TOSOH公司）纯化介质粒径分布范围：40-90微米纯化介质孔径大小：1000埃Toyopearl DEAE-650M填料的其他指标请参照产品说明书。
2、纯化介质使用量的算出工艺路线一：从血浆直接制备八因子回收率：根据进料量的不同，回收率会出现差异。
经验表明，回收率一般在50-90%。
（我们的目标为>70%）纯度：100-500 I.U./mg·八因子前提假设1：0.5I.U.·八因子/mL·血浆DEAE-650M的载量：50 I.U.·八因子/mL·DEAE-650M每mL DEAE-650M的血浆处理量：100 mL·血浆/mL·DEAE-650M·批次前提假定2：使用50L的DEAE-650M纯化介质50L DEAE-650M的血浆处理量：5,000L·血浆/50L·DEAE-650M·批次前提假定3：纯化介质在使用15-20个批次后进行更换50L DEAE-650M使用15-20个批次后的血浆处理总量：75,000L-100,000L·血浆/50L·DEAE-650M·（15-20）批次前提假设4：每L血浆重量为1Kg50L DEAE-650M使用15-20个批次后的血浆处理总量：75-100吨·血浆/50L·DEAE-650M·（15-20）批次结论：采用工艺路线一、并结合上述前提假定的情况下，当使用50L DEAE-650M填料进行八因子的纯化时，累计可处理75-100吨血浆原料。
