基因工程药物的分离纯化(ppt)
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基因工程药物 ppt课件
基因工程药物 （工程菌）
PPT课件
1
基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操 作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体 细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在 受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病 的蛋白质，即基因疫苗或药物。
PPT课件
2
工程菌
• 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一 般称为“工程菌”。
PPT课件
3
目录
六6 采取的措施
五5 基因工程药物的安全性及质量 检控
四4 基因工程药物的技术路线
三3 基因工程药物的特点
二2 利用微生物生产药物的优越性
一1 基因工程药物的种类
PPT课件
4
一、基因工程药物的种类
• 用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正 常的细胞。
• 当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯 化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而 生物活性迥异的变异体。
PPT课件
17
六、采取的措施
• 构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使 其在诱导条件下才能有效表达。
PPT课件
19
• 目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性， 转基因生物有可能隐藏某些危害性。
• 基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培 养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质 量的不稳定性。
• 在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗 药性。
PPT课件
1
基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操 作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体 细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在 受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病 的蛋白质，即基因疫苗或药物。
PPT课件
2
工程菌
• 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一 般称为“工程菌”。
PPT课件
3
目录
六6 采取的措施
五5 基因工程药物的安全性及质量 检控
四4 基因工程药物的技术路线
三3 基因工程药物的特点
二2 利用微生物生产药物的优越性
一1 基因工程药物的种类
PPT课件
4
一、基因工程药物的种类
• 用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正 常的细胞。
• 当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯 化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而 生物活性迥异的变异体。
PPT课件
17
六、采取的措施
• 构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使 其在诱导条件下才能有效表达。
PPT课件
19
• 目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性， 转基因生物有可能隐藏某些危害性。
• 基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培 养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质 量的不稳定性。
• 在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗 药性。
基因工程制药par(1)幻灯片
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子
转录
核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
翻译
外源基因在大肠杆菌中的表达
启动子
外源基因在大肠杆菌中的表达
Lac 表达系统
启动子
以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统
转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为：
一、概 述
制备基因工程药物的一般程序
获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌（或细菌）
培养工程菌 除菌过滤
半成品检定 包装
一、概 述
传统制药存在的问题
1. 许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内 源性活性物质（如激素、细胞因子、神经多肽、调 节蛋白、酶类等人体活性多肽）以及某些疫苗，由 于材料来源困难或者制造技术问题而无法研制出产 品而付诸应用。
2. 从动物脏器中提取出来（比如动物脑垂体中的一 些肽类激素，包括肾上腺皮质激素、催产素起引产 或催产作用，胃肠道类激素缓激肽等），也因造价 太高，或来源困难而供不应求。
一、概 述
传统制药存在的问题
3. 由于免抗原等缘故（由于酶的相对分子量较大，对 人体可能具有抗原性，因此动物酶如作为注射用药 要经过大量的药理实验），使他们在使用上受到限 制。
Lac、Tac表达系统的宿主菌。
但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调 控，在使用高拷贝复制子的构建表达载体时，仍能观 察到较高水平的本底转录。
需在表达载体中插入lacq基因以保证有较多的Lacl阻遏
三、目的基因的表达
一、宿主细胞的选择
① 容易获得较高浓度的细胞； ② 能利用易得廉价原料 ③ 不致病、不产生内毒素 ④ 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态 ⑤ 容易进行代谢调控 ⑥ 容易进行DNA技术操作 ⑦ 产物的产量、产率高，且易提取纯化。
《基因工程制药》课件
、改变细胞特性等。
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因工程药物分离纯化
2
第十节 基因工程药物的分离纯化
基因工程药物或生物技术产品特点
(3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属 离子、 有机溶剂、剪切力、表面张力等十分 敏感，容易使其失 活、变性；
(4) 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物 以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；
离子交换纤维素 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状 结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白 质）的交换容量比离子交换树脂大。
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM 纤维素）等 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）
子或阴离子起交换作用
如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时
各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数
吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变 pH 使吸附的蛋白质失去电 荷而解离下来
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有
差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱
25
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
常用的离子交换葡聚糖包括
阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25， CM-Sephadex C-50
Sephadex C-25，
Sephadex C-50
阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25， DEAE-Sephadex A-50
QAE-Sephadex A-25， QAE-Sephadex A-50
（2）原材料和培养基的来源及其质量是否稳定：
4
一、建立分离纯化工艺的需了解的各种因素
第十节 基因工程药物的分离纯化
基因工程药物或生物技术产品特点
(3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属 离子、 有机溶剂、剪切力、表面张力等十分 敏感，容易使其失 活、变性；
(4) 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物 以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；
离子交换纤维素 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状 结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白 质）的交换容量比离子交换树脂大。
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM 纤维素）等 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）
子或阴离子起交换作用
如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时
各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数
吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变 pH 使吸附的蛋白质失去电 荷而解离下来
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有
差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱
25
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
常用的离子交换葡聚糖包括
阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25， CM-Sephadex C-50
Sephadex C-25，
Sephadex C-50
阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25， DEAE-Sephadex A-50
QAE-Sephadex A-25， QAE-Sephadex A-50
（2）原材料和培养基的来源及其质量是否稳定：
4
一、建立分离纯化工艺的需了解的各种因素
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
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①配基固定化 ②吸附目的物 ③样品解吸
⑷凝胶过滤
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔 性凝胶作为分离介质，小分子能进 入孔内，在柱中缓慢移动，而大分 子不能进入孔内，快速移动，利用 这种移动差别可使大分子与小分子 分开。
根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子 的动力学体积的大小差异，可以利用 凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
⑵反相色谱 和 （reversed phase chromatography，RPC） 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质 疏水性的差异来分离纯化的。
反相色谱是利用溶质分子中非 极性基团与非极性固定相之间相互作 用力的大小以及溶质分子中极性基团 与流动相中极性分子之间在相反方向 作用力的大小差异进行分离的。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进 行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根 据其分子的理化性质和生物学 特性来决定。
产物的特性在分离纯化中的作用
产物特性 等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
作
用
决定离子交换种类及条件
选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度
决定亲和配基
决定分离体系及蛋白浓度
决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的方法依赖色谱分离方法
⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC）
离子交换层析的基本原理是通过带电的 溶质分子与离子交换剂中可交换的离子 进行交换，从而达到分离的目的。
它具有分辨率高容量大操作容易，该法 已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要 方法。
常用固定相为硅胶烷基键合相。
流动相为低离子强度的酸性水溶 液，加入能与水互溶的乙腈、甲 醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架疏水性强，吸附 的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱 下来。
疏水色谱的原理与反相色谱的原 理相似，主要是利用蛋白质分子表面 上的疏水区域和介质中的疏水基团之 间的相互作用，无机盐的存在能使相 互作用力增强。
⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
四、选择分离纯化方法 的依据
⒈根据产物表达形式来选择
分泌型表达产物的发酵液体积很 大但浓度较低纯化前必须浓缩可 用沉淀和超滤法。
产物在周质表达是介于细胞内可溶性 表达和分泌表达的一种形式,它可以 避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白 类杂质,在一定程度上有利于分离纯 化.为了获得周质蛋白
基因工程药物的分 离纯化(ppt)
②含有大量细胞及代谢产物；
③表达产物稳定性差，易失活变 性；
④表达产物的种类繁多、结构不 一、活性各异；
⑤对其质量要求纯度高、无菌、 无热原。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的 各种因素对分离、纯化工艺有影响。 包括：
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离 子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离 子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸 性，可选择条件使其吸附在阳离子交 换剂上，而DNA不吸菌科产生 的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。 分子量小的多肽或蛋白质中的热原可 用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可 用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏 水性可用疏水层析法。
①菌种的类型及其代谢特性。 ②原材料培养基的来源及其质量。 ③生产工艺及条件。
⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求
二 、分离纯化的基本过程
发酵液
细胞分离 胞内产物
胞外产物
细胞破碎
固液分离
浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
包含体 细胞碎片分离
变性
复性
三、分离纯化的技术
主要应用两个方面：
①脱盐和更换缓冲液
②蛋白质分子的分级分离。
在产品的形成阶段前用于除去产物的 多聚体及降解产物。
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0
以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性， 可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层析也有效。 ⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂 多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用 超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去， 脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 ⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和 生物学特性来决定。
产物特性
作
用
等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
决定离子交换种类及条件 选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度 决定亲和配基
决定分离体系及蛋白浓度 决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物
活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物
中有效的将目的产物分离，达 到较高的纯化倍数。
③收率要高。 ④两个技数间能直接衔接，
不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高
生产率的要求。
⒈细胞破碎与固液分离
⑴细胞收集： 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械 破碎法。 ⑶固液分离
固定相介质表面的疏水性比反相 色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚 合物键合相或大孔硅胶键合相。
流动相为pH6～8盐水溶液。
在高盐浓度时，蛋白质分子中疏 水性部分与介子的疏水基团产生疏水 性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白 质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐 步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗 脱时间越长。
与反相色谱相比，疏水色谱回收 率较高，蛋白质变性可能性小。
⑶亲和层析（affinity chromatography，AC）
亲和层析是利用固定化配基与 目的蛋白质之间特异的生物亲 和力进行吸附，如抗体与抗原、 受体与激素、酶与底物之间的 作用。
配基：在亲和层析中起可逆性结 合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步：
⑷凝胶过滤
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔 性凝胶作为分离介质，小分子能进 入孔内，在柱中缓慢移动，而大分 子不能进入孔内，快速移动，利用 这种移动差别可使大分子与小分子 分开。
根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子 的动力学体积的大小差异，可以利用 凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
⑵反相色谱 和 （reversed phase chromatography，RPC） 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质 疏水性的差异来分离纯化的。
反相色谱是利用溶质分子中非 极性基团与非极性固定相之间相互作 用力的大小以及溶质分子中极性基团 与流动相中极性分子之间在相反方向 作用力的大小差异进行分离的。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进 行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根 据其分子的理化性质和生物学 特性来决定。
产物的特性在分离纯化中的作用
产物特性 等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
作
用
决定离子交换种类及条件
选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度
决定亲和配基
决定分离体系及蛋白浓度
决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的方法依赖色谱分离方法
⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC）
离子交换层析的基本原理是通过带电的 溶质分子与离子交换剂中可交换的离子 进行交换，从而达到分离的目的。
它具有分辨率高容量大操作容易，该法 已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要 方法。
常用固定相为硅胶烷基键合相。
流动相为低离子强度的酸性水溶 液，加入能与水互溶的乙腈、甲 醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架疏水性强，吸附 的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱 下来。
疏水色谱的原理与反相色谱的原 理相似，主要是利用蛋白质分子表面 上的疏水区域和介质中的疏水基团之 间的相互作用，无机盐的存在能使相 互作用力增强。
⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
四、选择分离纯化方法 的依据
⒈根据产物表达形式来选择
分泌型表达产物的发酵液体积很 大但浓度较低纯化前必须浓缩可 用沉淀和超滤法。
产物在周质表达是介于细胞内可溶性 表达和分泌表达的一种形式,它可以 避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白 类杂质,在一定程度上有利于分离纯 化.为了获得周质蛋白
基因工程药物的分 离纯化(ppt)
②含有大量细胞及代谢产物；
③表达产物稳定性差，易失活变 性；
④表达产物的种类繁多、结构不 一、活性各异；
⑤对其质量要求纯度高、无菌、 无热原。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的 各种因素对分离、纯化工艺有影响。 包括：
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离 子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离 子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸 性，可选择条件使其吸附在阳离子交 换剂上，而DNA不吸菌科产生 的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。 分子量小的多肽或蛋白质中的热原可 用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可 用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏 水性可用疏水层析法。
①菌种的类型及其代谢特性。 ②原材料培养基的来源及其质量。 ③生产工艺及条件。
⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求
二 、分离纯化的基本过程
发酵液
细胞分离 胞内产物
胞外产物
细胞破碎
固液分离
浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
包含体 细胞碎片分离
变性
复性
三、分离纯化的技术
主要应用两个方面：
①脱盐和更换缓冲液
②蛋白质分子的分级分离。
在产品的形成阶段前用于除去产物的 多聚体及降解产物。
⒊非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0
以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性， 可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层析也有效。 ⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂 多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用 超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去， 脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 ⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和 生物学特性来决定。
产物特性
作
用
等电点 相对分子量 疏水性 生物特异性 溶解性 稳定性
决定离子交换种类及条件 选择不同孔径的介质
与疏水、反相介质结合的程度 决定亲和配基
决定分离体系及蛋白浓度 决定工艺采用温度及流程时间
分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物
活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物
中有效的将目的产物分离，达 到较高的纯化倍数。
③收率要高。 ④两个技数间能直接衔接，
不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高
生产率的要求。
⒈细胞破碎与固液分离
⑴细胞收集： 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械 破碎法。 ⑶固液分离
固定相介质表面的疏水性比反相 色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚 合物键合相或大孔硅胶键合相。
流动相为pH6～8盐水溶液。
在高盐浓度时，蛋白质分子中疏 水性部分与介子的疏水基团产生疏水 性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白 质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐 步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗 脱时间越长。
与反相色谱相比，疏水色谱回收 率较高，蛋白质变性可能性小。
⑶亲和层析（affinity chromatography，AC）
亲和层析是利用固定化配基与 目的蛋白质之间特异的生物亲 和力进行吸附，如抗体与抗原、 受体与激素、酶与底物之间的 作用。
配基：在亲和层析中起可逆性结 合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步：