肝脏生理及病理蛋白质组学研究新进展

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【１５】ＭＵＲＰＨＹ ＦＲ，ＩＳＳＡ Ｒ，ＺＨＯＵ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐ－
ｔｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ一１ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｌｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２，２７７（１３）：１１０６９－１ １０７６．
一、肝脏发育蛋白质组学研究 了解肝脏发育和再生有助于了解急慢性肝病的发生机制， 也有助于通过治疗介入来控制肝脏的再生过程。贺福初和钱小 红等对人类胚胎肝蛋白质组进行了系统性鉴定，研究包括蛋白 质表达谱、磷酸化蛋白谱、蛋白质相互作用链接图的构建以及胚 胎肝蛋白质组与其转录组之间的比较。该研究通过蛋白质组学 技术的结合，到目前为止从６４９６０个肽段中鉴定出２４９５个特殊
ｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｉｎ ｏｒｇａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００４，１６５（１）：１６７—１７４．
（收稿：２００８—０５—２１） （校对：郭顺明）
肝脏生理及病理蛋白 质组学研究新进展
丁赛丹
【摘要】蛋白质组学已被广泛用于研究肝病的发病机制和寻找相关生物标记物等研究。本文主要介绍近年来蛋白质 组学在肝脏再生、病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等研究中的若干进展。
ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｌＪ】．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ，２００２，１７（７）：７９１－
７９９．
【１９】ＣＡＳＵ Ａ，ＢＡＳＳＩ ＡＭ，ＣＡＮＥＰＡ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｉｏａｅｅｔａｍｉｄｅ ｉＩｎ－ ｐａｉｒｓ ｒｅｔｉｎｏｌ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｄｏｌｉｃｈｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ［ｊ］．Ｂｉｏｅｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｅｔａ，２００２，１５８３（３）·２６６－２７２．
作者单位：２０１２０３上海市上海中医药大学中医基础理论教研室 作者简介：丁赛丹女，２６岁，博士研究生。Ｅｍａｉｌ：ｆｌｒｓｔｄｓｄａｎ＠１６３．ｃｏｒｎ
蛋白，其中２２３个新蛋白和１５个新肽段没有现有的已知蛋白质 序列。另外，他们对胚胎肝蛋白质组与转录组进行比较发现，无 论在定性和定量水平上两者相关性都很低。该研究组还建立了 人类胚胎肝磷酸化蛋白质表达谱，至少包括１２５个特殊的磷酸 化蛋白质和３６个确定的磷酸化位点，并通过酵母双杂交系统、 计算机分析和相互作用数据库采矿等方法获得了６８４个蛋白质 所具有的７２９种相互作用图。因此，人类胚胎肝蛋白质组的整合 图谱是目前最全面地研究特定器官或组织蛋白质组的代表［３１。
四、肝细胞癌蛋白质组学研究 （一）血清标记物Ｓｃｈｗｅｇｌｅｒ等”５采用ＳＥＬＤＩ—ＴＯＦ ＭＳ分析 慢性丙型肝炎发展到肝细胞癌（ＨＣＣ）整个过程的１７０个血清样 品（无肝病患者３９例，慢性丙肝无肝硬化患者３６例，兼肝硬化 患者３８例，兼ＨＣＣ患者５７例）的蛋白质生物标记物，得到各组 蛋白质图谱，并产生敏感度／特异性较高的决策分级树，可用于确 定病人所处慢性肝病的发展阶段。Ｗａｒｄ等ｆｌ回采用ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ／ ＭＳ分析１８２例慢性丙型肝炎所致的肝硬化患者（其中肝细胞癌 患者７７例）的血清蛋白质组，并建立１７个人工神经网络，用此 方法达到９４％的灵敏度和８６％特异性，远远高于传统的生物标 记物ＡＦＰ。并且对ＨＣＣ患者和非ＨＣＣ患者的血清进行分析比 较，发现有２个ＳＥＬＤＩ峰（２３１２３．５ ｋＤａ）平均抬高了５０％，鉴定 为Ｋ和入免疫球蛋白轻链。Ｐａｒａｄｉｓ等”７噪用ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ鉴 定８２例肝硬化患者（无ＨＣＣ患者３８例，兼有ＨＣＣ患者４４ 例）血清中的ＨＣＣ标记物，研究发现３０个蛋白的峰强度在无 ＨＣＣ肝硬化患者与有ＨＣＣ肝硬化患者之间有显著差异。最高的 差异峰（８，９００ Ｄａ）被纯化且被鉴定为玻璃体结合蛋白片段的ｃ 末端部分。体外研究曾指出ＨＣＣ患者血清中８９００Ｄａ片段的增 多是因为天然玻璃体结合蛋白的断裂。所以，玻璃体结合蛋白片 段可以成为慢性肝病患者发展到ＨＣＣ新的血清标记物。 Ｃｈｉｇｎａｒｄ等Ｉ－ｑ在ＨＣＣ患者血清中检测到钙网织蛋白和ＰＤＩ— Ａ３碎裂产物，这些碎裂产物在ＨＣＣ患者和健康个体之间，以及 ＨＣＣ患者与处于危险病人（患有慢性肝炎或肝硬化）之间的表达 水平存在着显著的差异。 （－－）组织标记物有学者比较肿瘤组织与正常组织蛋白质 表达差异，并已寻找到一些有显著差异的蛋白，如组织铁蛋白轻 链（Ｔ—ＦＬＣ）在肿瘤组织中低表达，有望成为监测ＨＣＣ化疗效果 的关键分子。ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＳＯＣＳＩ【１９－２０ｔ、ｇｐ９６＇２１１、钙网织蛋白、ＰＤＩＡ３、 蛋白质二硫键异构酶（ＰＤＩ）和胃泌素释放肽（ＧＲＰ７８）【ｌ砖芷肿瘤组 织中高表达，这些蛋白将与肿瘤的预测相关。 蛋白质组学与其它方法的结合成为目前较新颖和有效的筛 选蛋白生物标记物的有效手段。Ｃｌｉｆｔｏｎ等嘲采用分步提取膜蛋白 的方法和ＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ／ＭＳ方法对正常小鼠肝脏和肝癌组织进行 蛋白表达差异比较，发现大多数差异蛋白为膜联蛋白（ａｎｎｅｘｉｎ） 和热休克蛋白家族的成员，该类蛋白质已成为肝细胞癌潜在的 候选生物标记物。Ｌｕｋ等Ｉ∞】应ｆ用人工神经网络和决策树数据采矿 方法分析图谱数据描绘显著差异模式和趋势，成功地从非恶性 肝样品中区分ＨＣＣ表型，检测灵敏度和特异性超过８０％。他们 从决策树模式中分类出３个生物标记物（细胞色素ｂ５、热休克 ７０ｋＤａ异构体２和组织蛋白酶Ｂ）。蛋白质组图谱方法结合ＡＮＮ
ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ阴．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，２９２（１）：３９５—４０１． 【１８】ＶＯＬＬＭＡＲ Ｂ，ＨＥＣＫＭＡＮＮ Ｃ，ＲＩＣＨＴＥＲ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ，
ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｏｗ，ｄｉｅｔａｒｙ ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ａｇｇｒａｖａｔｅ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ
万方数据
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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表达下调。Ｙａｎｇ等ｍ对ＨＢＶ转基因小鼠的肝脏蛋白质和代谢产 物图谱进行研究，发现ＨＢＶ一转基因小鼠肝脏中抗氧化应激保护 酶和脂类代谢相关的调节蛋白表达明显改变。他们通过代谢组 学研究发现脂类代谢中间产物及终产物都有明显改变，并验证 了脂类代谢的紊乱。此研究结果证明了ＨＢＶ抗原可以扰乱宿主 细胞脂类代谢，以及诱导一定的氧化应激。
ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ【Ｊ】．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２００４，４２８ （１）：９２—９８． 【２１】ＬＡ，Ｉ＇ＥＥＦ Ｈ，ＳＴＥＶＥＮＳ ＭＪ，ＶＡＲＡＮＩ Ｊ．ＡⅡ一ｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎｏｉｃ
ａｃｉｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｌ—
【关键词】蛋白质组学；发育；病毒性肝炎；肝硬化；肝细胞癌
直到今天，我们在肝病诊断、分期及治疗上的策略仍有着很 大的局限性。在肝组织样本中进行蛋白质标记对于诊断学的发 展十分有用。另外，血浆中的许多蛋白质都在肝脏中合成，这些 蛋白质在数量和结构上的改变都对肝病有所反应，且对其它器 官中的炎症和疾病过程也有所反应。随着后基因组时代的到来， 蛋白质组学已成为一个发展迅速和日益重要的研究领域。蛋白 质组是指在特定的时间和空间上一种细胞、组织及生物体的基 因组所表达的全部相应蛋白质，包括各种亚型及蛋白质修饰，它 随着时问和外界因素的影响而动态变化着ｆ１１。因此，开展肝病蛋 白质组学研究将有助于阐明肝病发生发展的分子机制，也是寻 找肝病相关蛋白质和标志物，以及新的治疗靶点的有效途径１２１。
【２０］ＷＡＮＧ Ｌ，ＴＡＮＫＥＲＳＬＥＹ ＬＲ，ＴＡＮＧ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ ２（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ
ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
三、肝硬化蛋白质组学研究 肝纤维化长期渐进性发展导致肝硬化，此过程与细胞外机 制的蛋白质修饰相关。在脏器纤维化或硬化的组织学水平被发 现之前，实际上成纤维细胞的分泌谱中早已有所改变。因此差异 蛋白质组学常被用来鉴定检测早期纤维化的有关事件蛋白质标 记物。 星状细胞是肝纤维化的主要效应细胞，所以针对星状细胞 的研究将是寻找肝纤维化标记物的最直接的方式。早在２０００年 就有学者开始研究体内外激活星状细胞差异蛋白表达组，证实 了钙周期蛋白、半乳凝素参与了调节肝星状细胞的激活田。之后 又采用原蛋白质组学技术从ｗｉｓｔａｒ大鼠肝中鉴定出星状细胞激 活相关蛋白质（ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＴＡＰ）。 ＳＴＡＰ是一种亚铁血红素蛋白，它具有催化过氧化氢和脂类过氧 化物的过氧化物酶活性，起到清除过氧化物抗纤维化的清道夫 作用，因此可作为肝星状细胞的标记物【９】。他们又对人类肝星状 细胞激活相关蛋白质进行鉴定（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ— ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈＳＴＡＰ），结果显示ｈＳＴＡＰ功能与大鼠肝星状 细胞激活相关蛋白质相似，可以作为人类肝脏静止星状细胞的 生物标记物１１０ｔｏ 研究肝硬化病人的血清蛋白质组学已成为寻找肝硬化生物 标记物的有效手段。Ｘｕ等｜１１噪用比较先进的辅助激光解析电离 技术（ＳＥＬＤＩ－，ｍＦ）寻找硫代乙酰胺诱导的肝硬化和胆管结扎诱 导的肝硬化患者血清生物标记物，并获得蛋白谱，再通过回归支 持矢量机器运算规则ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ ａｉｇｏ— ｒｉｔｈｍ）对蛋白谱数据进行筛选，选择出有统计学差异的生物标记 物。３４９５Ｄａ蛋白是其中有差异的蛋白质，并通过鉴定发现此蛋 白与富含组氨酸的糖蛋白具有同源性。Ｚｈｕ等０２采用ＳＥＬＤＩ蛋白 质芯片技术比较正常人和ＨＢＶ感染引起的肝硬化患者。发现了 相对分子质量为７ ７７２ ０００Ｄａ和３ ９３３ ０００Ｄａ的蛋白质在非肝 硬化组中表达，而在ＨＢＶ感染的肝硬化患者中不表达。用这两 个蛋白进行盲法检验时，灵敏度达到８０％。特异度达到８１．８％， 阳性预测值为７５％。 Ｐｏｏｎ等【，３１更进一步构建肝硬化人工神经网络模型，他们采 用ＳＥＬＤＩ蛋白芯片阵列研究４６例慢性肝炎患者的血清蛋白质 组学指纹谱，获得了３０个蛋白质峰。然后用肝纤维化相关蛋白 质组学指纹谱构建人工神经网络（ＡＮＮ）模型，产生了０－６个等 级的纤维化索引。交叉验证法显示ＡＮＮ纤维化索引与Ｉｓｈａｋ得 分密切相关，且纤维化每个阶段之间都有明显差异。预测有效的 纤维化（Ｉｓｈａｋ得分＝３）和硬化（１ｓｈａｋ得分３５）的ＲＯＣ曲线面积 分别为０．９０６和０．９２１。在特异性为８９％的条件下，预测肝纤维 化的ＡＮＮ纤维化索引灵敏度为８９％，且预测的灵敏度随着纤维