低聚壳聚糖制备及产物的膜分离技术研究

合肥学院学报(自然科学版)Journal of Hefei University(Natural Sciences)　2009年8月　第19卷第3期 Aug.2009Vol.19No.3　低聚壳聚糖制备及产物的膜分离技术研究苏　丹1,丁　明2(1.安徽大学化学化工学院,合肥　230039;2.合肥学院粉体与新能源材料重点实验室,合肥　230022)摘　要:利用乙酸—过氧化氢体系,在均相和酸性条件下降解壳聚糖,考察了反应温度、乙酸浓度和过氧化氢浓度对氧化降解反应的影响.用正交试验确定了最佳制备工艺条件:反应温度70℃,乙酸浓度1%,过氧化氢浓度3%,反应时间10h.对降解产物利用超滤膜分离技术进行后处理,获得平均分子量在10000以上、5000～10000和5000以下3个不同分子量分布段的低聚壳聚糖产物.低聚壳聚糖5000～10000分子量分布段平均分子量为7300左右,最终产率为37%.关键词:壳聚糖;低聚壳聚糖;降解;超滤中图分类号:O636.1 文献标识码:A 文章编号:1673-162X(2009)03-0063-05每年自然界生物合成的甲壳素将近100亿t,是除纤维素外最丰富的天然高分子化合物.甲壳素由于其分子结构中氢键的相互作用,形成了有序的大分子结构,它不溶于水、稀酸、稀碱和一般有机溶剂.壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰基的产物.一般而言,N-乙酰基脱去55%以上的甲壳素就可称之为壳聚糖,其分子量从数十万至数百万不等.由于壳聚糖分子中有游离氨基的存在,其溶解性大大优于甲壳素,同时仍具有甲壳素的无毒、生物相容性好等优点,所以国内外学者对壳聚糖的研究十分活跃,其应用领域也不断拓宽,作为新型功能生物高分子在食品、药剂学、生物材料、医学和化妆品等诸多领域已得到了广泛的应用[1].将壳聚糖转化为能直接溶于水的低聚壳聚糖是人们改性壳聚糖研究中比较重要的方向之一.近年来不断发现特定分子量分布段的低聚壳聚糖具有抗微生物和抗肿瘤等生物活性[2,3],更加促使各国学者越来越关注低聚壳聚糖的研究与开发.目前壳聚糖的降解方法大致分为酸降解法、酶水解法、氧化降解法和物理降解法四大类[4],其中过氧化氢氧化降解因成本低、降解速度快、产物无残毒和易实现工业化生产等优点而备受关注.目前,影响低聚壳聚糖广泛应用和提高应用产品功能特性的最主要问题之一是高纯、窄分子量分布的低聚壳聚糖产品制备,突出的是大分子产物的高效、精细分离技术的实现.本文利用乙酸—过氧化氢体系降解工艺,进一步优化工艺参数,研究超滤膜分离技术在壳聚糖降解产物的分离纯化方面的应用,获得分离工艺最佳参数,同时得到多种不同分子量分布段的高品质低聚壳聚糖产品.1　试　验1.1　试验原料与仪器　原料:壳聚糖(浙江玉环海洋生物化学有限公司,分子量1.38×106;脱乙酰度87%);过氧化氢(30%,分析纯);冰醋酸(分析纯);氢氧化钠(分析纯)等.仪器:RE52CS旋转蒸发仪、SC M杯式超滤系统(合肥风云机电科技有限公司)等.1.2　试验方法　降解试验:将4g壳聚糖置于三口烧瓶中,按1∶100(W/V)溶于适量乙酸溶液,置于所需温度的水浴锅中,搅拌至壳聚糖完全溶解,用酸式滴定管逐滴滴加一定量的30%过氧化氢,搅拌反应一定时间后,逐滴加入0.01mol・L-1Na OH溶液,搅拌,调节溶液pH值为7.0,然后将三口烧瓶从水浴锅中取出,冷却.超滤膜分离试验:将中性的降解产物溶液移至超滤系统中,在0.2MPa压力下用截留分子量为10000的超滤膜M21进行超滤分离,得到截留液1和透过液1,然后将透过液用截留分子量为5000的超滤膜M22收稿日期:2009-05-04 修回日期:2009-06-18作者简介:苏　丹(1982—),男,湖南常德人,安徽大学化学化工学院2006级硕士研究生,研究方向:天然生物大分子;丁　明(1963—),男,安徽合肥人,合肥学院粉体与新能源材料重点实验室教授,研究方向:粉体材料.再次超滤,得到截留液2和透过液2.将截留液1、2分别干燥至恒重,称量.使用后的超滤系统采用稀乙酸溶液进行清洗.工艺总流程图如图1所示.1.3　检测与表征图1　壳聚糖原料降解———超滤膜分离工艺流程图1.3.1　特性粘度的测定　在25℃水浴中用乌氏粘度计测定去离子水的流出时间t 0,然后精确称取干燥至恒重的低聚壳聚糖样品1g (称量精度为0.0001g ),用去离子水配成不同浓度的样品溶液,移入乌氏粘度计测定样品溶液流出时间t,将溶液浓度c 在图ηsp /c v -c 上外推至0,得到特性粘度[η].1.3.2　粘均分子量的计算　以Mark 2Hou wink 方程式[η]=K M αη来计算壳聚糖的粘均分子量.其中K =1.64×10-30・DD14.0,α=-1.02×10-2・DD +1.82,DD 是壳聚糖的脱乙酰度[5].2　讨　论2.1　降解工艺　过氧化氢降解可以在酸性、碱性和中性条件下进行.在碱性和中性介质中,由于本试验所用壳聚糖原料溶解性差,降解是非均相反应,反应慢且不均匀,而壳聚糖能溶解于酸性介质中,因而反应是均相反应,反应快且均匀性好,介质可以是乙酸和盐酸,在盐酸中产物分子量分布较宽[6].为了使平均分子量在5000～10000分布段的低聚壳聚糖产率最高,本试验采用乙酸—过氧化氢体系,在均相和酸性条件下降解壳聚糖.在降解试验探索阶段,将反应时间设为6h,中和降解产物溶液,得到粘稠胶体,无法采用本试验中的超滤系统进行超滤,表明在此反应时间下,大分子壳聚糖未能充分降解.延长反应时间至8h,仍不理想.继续延长至10h,方能进行超滤试验.充分降解所需时间与其他人研究结果不同[7-9],这可能是由所用原料壳聚糖分子量和脱乙酰度的不同所造成的.为了确定最佳试验条件和探讨各因素对降解产物产率的影响,本试验固定反应时间为10h .2.2　膜分离工艺　降解产物可以用多种方法进行分离[10,11].但这些分离方法都需要在混合溶液中加入大量有机溶剂,且时常只能得到絮状胶体而不能得到所需沉淀,因此该法不适于工业化.此外,色谱法[12]和毛细管电泳法[13]也可以用来分离低聚壳聚糖混合物.然而,色谱法通常存在洗脱时间长,对样品有损耗等不足;毛细管电泳也因为毛细管直径小,光路太短,造成检测时灵敏度较低,而且,这两种分离方法都需要昂贵的仪器设备,进样量少,难以实现大规模分离低聚壳聚糖.超滤膜分离技术是一种能够将溶液进行净化、分离、浓缩的膜分离技术.本试验首先采用截留分子量为10000的超滤膜将降解中和后的溶液分离成两部分:截留液1和透过液1.截留液1中主要是分子量大于10000的壳聚糖,透过液1中含有分子量小于10000的水溶性低聚壳聚糖以及无机盐分.为了进一步提纯低聚壳聚糖,需对透过液1脱盐.随后,用截留分子量为5000的膜对透过液1超滤,得到截留液2和透过液2.截留液2即为本试验的目标产物,含有分子量为5000～10000的低聚壳聚糖,透过液2中因含有大量无机盐分而难以准确称量其中所含低聚壳聚糖的质量,因此在本试验中不对其另作处理.超滤分离过程中,用氮气提供推动力.与前面所述分离方法相比,用超滤膜对降解中和产物进行分离具有明显优势:设备简单、操作方便、高效快捷;其分离过程不涉及相变,无二次污染且能耗低,无需添加任何外来化学试剂,从而降低了分离成本,并减少了环境污染.2.3　降解技术条件优化研究2.3.1　反应温度对降解产率的影响　固定过氧化氢浓度为1%,在不同反应温度条件下,分子量为5000～10000分布段的低聚壳聚糖的产率如图2所示.46合肥学院学报(自然科学版)第19卷从图2中可以看到,在同一乙酸浓度条件下,当反应温度为60℃时,降解产率在20%左右,这是因为壳聚糖在此温度下缓慢降解,降解得到的低聚壳聚糖相对于未降解的壳聚糖与过氧化氢发生反应的位置点较少,因此分子量为5000～10000低聚壳聚糖的产率较高.当反应温度升高至70℃和80℃时,过氧化氢分解速率加快,从而加快了壳聚糖的降解反应速率.在此温度范围内,反应速率适中,壳聚糖不会完全降解为分子量很小的寡糖,同时也不会因为降解过于缓慢而造成大部分壳聚糖未降解,因此分子量为5000～10000低聚壳聚糖的降解产率相对于60℃时有所提高.进一步升高反应温度,降解反应更加剧烈,当反应温度达到90℃时,分子量为5000～10000低聚壳聚糖的产率很低,这是因为在此温度下壳聚糖剧烈降解为分子量更低的产物,透过截留分子量为5000的超滤膜,所以收集到的产物很少,降解产率很低.另外,在反应过程中还发现,升高反应温度使降解产物颜色有所加深,这可能是因为当温度较低时,由于反应活化能量不足而使副反应受到限制,随着温度的升高,在壳聚糖主链发生β2糖苷键断裂的同时,-NH 2脱落,形成了COOH [14].2.3.2　乙酸浓度对降解产率的影响　固定过氧化氢的浓度为4%,在不同乙酸浓度条件下,分子量为5000～10000分布段的低聚壳聚糖的产率如图3所示.在图3中发现,在同一反应温度条件下,分子量为5000～10000低聚壳聚糖的产率随着乙酸浓度的增大而呈下降的趋势.原料壳聚糖分子链上存在游离氨基,能与乙酸溶液中的氢离子不断地结合,形成-NH +3,当溶液中剩余的氢离子不多,亦即溶液中的离子强度较低时,壳聚糖分子链上的-NH +3因正电荷的同性排斥而使其分子链舒展,成为扩张型分子,溶解度增大,从而使活性氧化基团的进攻位点较多,有利于降解反应的发生.然而,当乙酸浓度过高时,壳聚糖分子链中的绝大部分-NH 2就会与H +结合形成R -NH +3缺电子体系,造成壳聚糖分子中自由氨基锐减,即主要存在的是乙酰氨基,过氧化氢进攻β-糖苷键受到乙酰氨基的位阻影响,这阻碍了氧化降解[6].图4　过氧化氢浓度对壳聚糖降解产率的影响2.3.3　过氧化氢浓度对降解产率的影响　固定乙酸浓度为1%,在不同过氧化氢浓度条件下,分子量为5000～10000分布段的低聚壳聚糖的产率如图4所示.从图4中可以看到,随着过氧化氢浓度的增大,分子量为5000～10000分布段低聚壳聚糖的产率变化情况较为复杂.在同一温度下,随着过氧化氢浓度增大,降解产物的分子量变得更低.在60℃时,降解产率随过氧化氢浓度增大而提高,这是因为在此反应温度下,壳聚糖分子量降低较慢,增加过氧化氢浓度,促使壳聚糖降解为目标产物.在70℃时,随着过氧化氢浓度的增大,降解产率首先提高,当过氧化氢浓度达到3%以后,进一步增大过氧化氢浓度,产率降低,这可能是因为过量的过氧化氢使目标产物进一步降解为分子量更低的产物.当温度上升到80℃时,降解产率的变化规律与70℃时类似,只是过氧化氢浓度大于2%时产率即开始降低,说明在高温下降解壳聚糖,主要56第3期苏　丹,等:低聚壳聚糖制备及产物的膜分离技术研究生成分子量在5000以下的低聚物.当温度达到90℃时,产率很小,生成的低聚合度糖和寡糖的含量增加.随着过氧化氢浓度的逐渐增大,虽然降解时间缩短,所得降解产物的分子量更低,但得到的产物颜色也逐渐加深,且产率降低,甚至得不到所需产物.当过氧化氢浓度太低时,反应速度慢,降解不充分.2.3.4　最佳降解条件的确定　以上影响H 2O 2降解壳聚糖的单因素分析表明,反应温度、乙酸浓度和过氧化氢浓度等因素都对H 2O 2降解壳聚糖的产率有较大影响,为确定最佳降解条件,设计的3因素4水平正交试验表及正交试验结果如表1和表2所示.R 表示各水平四次降解产率之和的平均值的极差.分析极差数据,可知各降解条件中,降解产率受反应温度的影响最大,过氧化氢浓度对降解产率的影响次之,乙酸浓度对降解产率的影响最小.16次试验结果中以第12号试验的降解产率为最高,故最终的最佳降解工艺条件为A 2B 1C 3,即反应温度为70℃,乙酸浓度为1%,过氧化氢浓度为3%.表1　正交试验因素水平实验因素实验水平1实验水平2实验水平3实验水平4反应温度/℃60708090乙酸浓度/(V /V )1234过氧化氢浓度/(V /V )1234表2　正交试验结果试验编号A (反应温度)B (乙酸浓度)C (过氧化氢浓度)降解产率/%11(60℃)1(1%)1(1%)2222(70℃)2(2%)2(2%)1033(80℃)3(3%)3(3%)3144(90℃)4(4%)4(4%)152(70℃)3(3%)4(4%)1861(60℃)4(4%)3(3%)2174(90℃)1(1%)2(2%)183(80℃)2(2%)1(1%)1293(80℃)4(4%)2(2%)21104(90℃)3(3%)1(1%)1111(60℃)2(2%)4(4%)21122(70℃)1(1%)3(3%)37134(90℃)2(2%)3(3%)1143(80℃)1(1%)4(4%)3152(70℃)4(4%)1(1%)20161(60℃)3(3%)2(2%)19R20.254.7511.75为了考察利用过氧化氢在均相条件下降解壳聚糖和超滤膜分离技术对降解产物进行后处理制备低聚壳聚糖是否可行,在最优反应条件下:乙酸浓度1%,过氧化氢浓度3%,反应温度70℃,反应时间10h,重复反应10次,得到如下表3的结果.由表中结果可以看到,该技术的降解产率的精密度和准确度分别为0.9944(以标准偏差表示),-0.0270～0.0540,平均分子量的精密度和准确度分别为24.0370(以标准偏差表示),-0.0041～0.0051.可见,采用超滤膜分离技术对降级产物进行后处理,不仅工艺简单易行,而且产率稳定.3　结束语通过考察壳聚糖在乙酸—过氧化氢溶液中的氧化降解行为,发现反应温度、乙酸和过氧化氢浓度对降解产率起着重要的作用.当乙酸和过氧化氢浓度固定时,温度升高,产率随之而提高,但温度过高,产率反而降低,且产物颜色变深.在本试验考察的范围内,增大乙酸的浓度,产率先提高后降低.在低温下增大过氧化氢浓度,产率提高,但当温度升高到80℃后,产率随着过氧化氢浓度的增大而明显降低.通过设计正交试验,确定最佳降解制备条件为:乙酸浓度1%,过氧化氢浓度3%,反应温度70℃,反应时间10h .在此反应条件下,氧化降解所得溶液经中和、超滤处理后,获得降解产率为37%,平均分子量在7300左右的低聚壳聚糖.采用超滤技术对降解产物进行分离,不仅工艺简单易行,而且产物分子量分布较窄,且产率稳定,有望实现工业化.表3　最佳降解反应条件下验证结果试验编号12345678910降解产率/%37363738393836373736平均分子量734073107300727072907320733072807280728066合肥学院学报(自然科学版)第19卷参考文献:[1]　M ajeti N V,Ravi Ku mar .A Revie w of Chitin and Chit osan App licati ons[J ].Reactive &Functi onal Poly mers,2000,46(1):1227.[2]　L iu Nan,Chen Xiguang,Park Hyunjin,et al .Effect of MW and Concentrati on of Chit osan on Antibacterial Activity ofEscherichia Coli[J ].Carbohydrate Poly mers,2006,64(1):60265.[3]　Q in Caiqin,Zhou Bo,Zeng L intao,et al .The Physicochem ical Pr operties and Antitu mor Activity of Cellul ose 2treatedChit osan[J ].Food Che m istry,2004,84(1):1072115.[4]　金鑫荣,柴平海,张文清.低聚水溶性壳聚糖的制备方法及研究进展[J ].化工进展,1998(2):17221.[5]　W angW ei,Bo Shuqin,L i Shuqing,et al .Deter m inati on of the Mark 2Hou wink Equati on f or Chit osans with D ifferent Degreesof Deacetylati on[J ].I nternati onal Journal of B i ol ogicalMacr 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were 70℃of reacti on te mperature,2%of HAc concentrati on,3%of hydr ogen per oxide concentrati on,and 10h of reacti on ti m e .The ultrafiltrati on me mbrane separati on technol ogy was used t o separate the degradati on p r oducts .Three oligochit osan p r oducts with different molecular weight distributi ons were obtained,whose average molecular weights were above 10000,5000-10000and bel ow 5000,res pectively .The ulti m ate yield of oligochit osan with average molecular weight of 7300is 37%.Key words:chit osan;oligochit osan;degradati on;ultrafiltrati on76第3期苏　丹,等:低聚壳聚糖制备及产物的膜分离技术研究。