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用两种方法检测乙肝表面抗原结果分析目的了解用ELISA法检测乙肝表面抗原和用化学发光法检测表面抗原两者之间的结果情况。
方法采集320例就诊人员的血液标本，分别用化学发光法与ELISA法检测。
结果320份标本中，发光法检测出40份阳性，280份阴性。
ELISA 法检测出42份阳性，278份阴性。
经χ2检验两者无显著性差异（P>0.05）。
结论ELISA法成本比较低，耗时长，实验的影响因素比较多，易出现假阳性。
化学发光法成本高，所需时间短，干扰因素少，不易出现假阳性。
标签：乙肝表面抗原；ELISA；化学发光流行病学调查结果显示，我国的乙型病毒肝炎感染性约达10%，乙肝的实验检测对其防治具有非常重大的意义[1]。
乙型肝炎病毒乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。
随着科学越来越进步，检测的手段也越来越多。
自20世纪70年代至今，诸多高敏感性的检测方法被广泛应用于临床免疫学的检测中，当中应用最为广泛的就属酶联免疫法（enzyme linked Immunosor bent assay，ELISA）[2]。
近几年，化学发光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）正逐渐发展，是一种敏感性较强的临床免疫学检测方法，有效解决了低浓度乙型肝炎病毒乙肝表面抗原的检测难题[3]。
现用ELISA法，化学发光法，这两种方法检测的相关性进行探讨。
1 资料与方法1.1一般资料标本来自于我院2016年3月1日～3月5日体检人员，共320例，男198例，女122例，年龄18～72岁，平均年龄为（39.5±8.4）岁。
1.2标本采集用红头采血管，真空抽取静脉血3 ml，标本静置后离心提取血清。
1.3检测试剂与仪器一种采用雅培化学发光HBsAg定量检测试剂盒，标本离心后，按照雅培I2000化学发光仪的操作规程检测。
乙肝表面抗体定性和定量两种检测方法相关性分析目的通过分析比较两种检测方法（ELISA法定性与电化学发光法定量）检测乙肝表面抗体（抗-HBs）的结果差异，探讨测定乙肝表面抗体（抗-HBs）的浓度值与定性检测结果s/co值之间的关系及对临床工作的指导意义。
方法用ELISA法定性与电化学发光法定量分别对96份标本进行检测分析。
结果电化学发光法结果在10mIU/ml判为阳性。
两种方法对乙肝表面抗体的对比检测结果分别见表1，表2。
由表1 、表2可以看出，HBsAb浓度值小于10mIU/ml和大于100mIU/ml 时，电化学发光法和ELISA法检测结果相近，用ELISA法基本能准确判定阳性和阴性。
但在10～100mIU/ml之间的标本电化学发光法共检测的36例阳性样本，ELISA法只有26例是阳性。
以10～50mIU/ml区段尤为显著。
整体来看电化学发光法检出阳性率为68.8%，ELISA法检测阳性率为59.3%。
2种方法检测差异显著，有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论在我国乙肝的感染率较高，由于HBsAb是一种保护性抗体，一旦人体受到隐性感染或经急性感染乙肝病毒并清除后，会产生HBsAb。
若人群接种乙肝疫苗后，机体也可产生HBsAb。
人体内的较高浓度的HBsAb可有效清除机体感染的乙肝病毒。
同时乙型肝炎又与肝癌的发生有密切的关系，因此，为防止乙肝的蔓延，要想达到控制乙型肝炎的的目的，就应该采用减少易感人群的方式。
据相关资料报道，HBsAb含量在10mIU/ml以上的人群并不都具有较强的免疫力。
HBsAb含量在10-100mIU/ml之间的人群对乙型肝炎的免疫力相对较弱，甚至不能预防乙肝病毒的感染。
相关资料表明只有HBsAb的含量大于100mIU/ml时，才具有抵抗乙肝病毒入侵的能力。
但也有研究者认为大于10mIU/ml可以用于个体免疫力强弱的评价[3]。
正是由于乙肝抗体定量检测的重要性，现在，很多实验室都开展了该项目的检测，它不仅能够判断是否需要接种乙肝疫苗还能对疫苗接种后的效果进行评估。
两种乙肝表面抗原免疫检测方法的比较分析谢晓羽发布时间：2023-06-07T08:37:09.213Z 来源：《中国医学人文》2023年5期作者：谢晓羽[导读] 对酶联免疫吸附法(ELISA)与胶体金法检测乙肝表面抗原(HBsAg)进行方法学比较。
方法以来我院体检的200例体检者作为研究对象，其血清标本同时用酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法检测乙肝表面抗原(HBsAg)，以酶联免疫吸附法(ELISA)为标准，对胶体金法的灵敏度、特异性进行评价。
结果①酶联免疫吸附法(ELISA)检测的阳性率虽高于胶体金法，但两者间的差异无统计学意义（P>0.05）。
②酶联免疫吸附法(ELISA)检测的灵敏度高于胶体金法，且两组间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论酶联免疫吸附法(ELISA)步骤多，时间长，特异性强，灵敏度高，适合批量检测。
胶体金法快速简便，单份检测，无需任何仪器，适合急诊检测，但灵敏度、特异性稍差，特别是针对小三阳和乙肝携带者有漏诊可能。
因此临床检验科室在实际工作中，应根据需要并结合工作情况选用检测方法。
武汉轻工大学医院湖北武汉 430023摘要：目的对酶联免疫吸附法(ELISA)与胶体金法检测乙肝表面抗原(HBsAg)进行方法学比较。
方法以来我院体检的200例体检者作为研究对象，其血清标本同时用酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法检测乙肝表面抗原(HBsAg)，以酶联免疫吸附法(ELISA)为标准，对胶体金法的灵敏度、特异性进行评价。
结果①酶联免疫吸附法(ELISA)检测的阳性率虽高于胶体金法，但两者间的差异无统计学意义（P>0.05）。
②酶联免疫吸附法(ELISA)检测的灵敏度高于胶体金法，且两组间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。
结论酶联免疫吸附法(ELISA)步骤多，时间长，特异性强，灵敏度高，适合批量检测。
胶体金法快速简便，单份检测，无需任何仪器，适合急诊检测，但灵敏度、特异性稍差，特别是针对小三阳和乙肝携带者有漏诊可能。
乙肝表面抗原的ELISA 法定量分析方法学验证摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsA g 标准品从浓度为8ng/ml 做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3 个浓度梯度5 复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。
结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%, 1.5ng/ml的RSD为16.78%,不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%勺要求，检测限LOD为0.172ng/ml ,低浓度样品(<1.5ng/ml )的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。
结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。
关键词：乙肝表面抗原ELISA 定量分析方法学验证、八前言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。
随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。
ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELIS A法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。
1. 材料与方法1.1 试剂盒乙肝表面抗原ELISA 法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品1.2 仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575 ；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱（DNP-9052）上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）;移液器；Tip头；EP管。
定性检测的重复性研究能够评估检测方法的精密度，而精密度是检验项目测定中最基本的性能指标，我们检测的批内重复性和批间重复性的CV值均小于规定的允许范围，性能符合要求。
定性试验用阴、阳性符合率来评价结果的准确度，我们使用2010年卫生部临检中心的三次感染性疾病血清标志物A类室间质评回报结果进行统计，符合率为100%。
同时我们对选取的HBsAg阳性（包括临界弱阳性标本）和阴性血清标本进行检测，阳性、阴性符合率均为10 0%，检测性能符合要求。
说明该检测方法的准确性较好，能够满足临床诊疗的需求。
临界值是指实验结果处于阴、阳性分界点时的样本中分析物浓度值，低于该值判断为阴性结果，高于该值判断为阳性结果，对于定性试验，临界值是一个医学决定水平。
定性试验的临界值直接决定了实验结果的检出率，因此必须对厂家提供的临界值进行验证。
本实验室H BsAg±20%浓度水平的样本位于临界值95%区间内，结果说明试剂生产厂家提供的检测项目临界值基本准确。
综上所述，通过对HBsAg的批内重复性、批间重复性、临界值验证、阳性符合率、阴性符合率的评价和分析，证实该检测系统的性能卓越，具有高灵敏度和高特异性，能够满足临床检测的要求。
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上，洗涤除去未结合的抗原。
2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗涤除去未结合的游离未结合物。
3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶催化底物反应生成有色产物。
在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的抗原有关。
该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。
血清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，这不是人为因素造成的。
在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求出检验报告，较难逐个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。
而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。
本文对检验工作中经常出现的如标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。
1.标本溶血由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显色，出现假阳性。
有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1]。
要认真做好标本的保存和处理工作，防止溶血。
2.标本受到污染标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，出现假阳性。
3.标本放置时间在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。
ELISA法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原结果分析目的：分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），对比结果，探讨两种方法检测乙肝表面抗原的应用价值。
方法：分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法检测768份18～65岁人群血清标本，对比乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测结果。
结果：胶体金免疫层析法检测出HBsAg阳性标本42份，阳性率5.47%。
ELISA法检测出HBsAg阳性标本46份，阳性率为5.98%，两种方法阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。
两种方法检测的符合率为97.39%。
胶体金免疫层析法的灵敏度为69.57%，特异度为98.61%。
结论：胶体金免疫层析法操作简便、快速，检测的特异度较高，但其灵敏度有限，有待提高。
标签：酶联免疫吸附试验法；胶体金免疫层析法；乙肝表面抗原乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病，是当前严重危害人类身体健康的传染病。
乙型病毒肝炎表面抗原（HBsAg）阳性是感染乙肝病毒的重要指标。
酶联免疫吸附试验（ELISA）法是目前我国检测乙肝HBsAg最为普及的方法，应用时间较早，而胶体金免疫层析法是近年来采用的免疫学检测方法。
本组研究资料采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法对768份18～65岁人群血清进行HBsAg检测，并对比检测结果。
现报告如下：1材料与方法1.1标本来源抽取18～65岁人群血清768份，采集无溶血、无脂浊的静脉血标本3～5ml，室温静置30min后，4000r∕min离心5min，充分分离血清待检。
1.2仪器与试剂乙肝五项胶体金快速检测板由上海科华生物科技有限公司提供，HBsAg试纸条由蓝十字生物药业有限公司提供；ELISA检测试剂由珠海丽珠生物科技有限公司公司提供；TDL-42A低速离心机；Unto-FLiudo全自动酶标洗板机；Unto-2010酶标仪。
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓名 Z P学号 0925400072班级 09级医学检验本科二班指导老师沈富兵二〇一三年四月乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。
方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。
结果HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。
结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。
【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。
乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。
酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。
此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。
毕业论文题目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓名：学号：专业：指导教师：教师职称：研究起止日期：研究提交日期：二○一三年十一月目录毕业论文乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证中文摘要 (1)英文摘要 (1)前言.................................................................................................... . (2)1.材料与方法 (3)1.1试剂盒 (3)1.2仪器 (3)1.3方法 (3)1.3.1 溶液配制 (4)1.3.2 铺板方案 (4)1.3.3 加样步骤 (5)2. 结果 (6)2.1 标准曲线与线性 (6)2.2 准确度（回收率）的验证 (6)2.3 精密度的验证 (7)2.3.1 板精密度的验证 (7)2.3.2 板间精密度的验证 (8)2.4 检测限（LOD）计算 (10)3. 讨论 (1)3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义 (10)3.2 常用定量分析方法 (11)3.3 方法概述 (11)3.4 方法学验证容 (12)3.5 结果分析及应用评价 (13)参考文献 (14)综述.................................................................................................... . (15)致.................................................................................................... . (18)乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证中文摘要目的：对蓝图生物工程生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）。
用纯化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中乙肝表面抗原（HBsAg）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的乙肝表面抗原（HBsAg）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）的存在与否。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
乙型肝炎表面抗原测定方法《说说乙型肝炎表面抗原测定方法》嘿，你知道吗？乙型肝炎表面抗原测定可是个挺重要的事儿呢。
这可不是啥玄乎的东西，就像我们生活里很多事儿一样，有它自己一套实实在在的办法。
我有个朋友，就叫他大刘吧。
大刘呢，他家里有个亲戚，听说以前怀疑得了乙肝，这下可把全家都给紧张坏了。
然后就去医院做各种检查，这乙型肝炎表面抗原测定就是其中很关键的一项。
这测定方法啊，最常见的有一种叫酶联免疫吸附试验，简称ELISA。
这就像是一场小小的微观世界里的“捉迷藏”游戏。
医生呢，会先取一点病人的血液样本，就那么一小管血。
这血液啊，看起来就红红的、黏黏的，可别小看这一小管，这里面可有大文章呢。
把这血液样本放到专门的小盘子里，这个小盘子可有很多小格子，就像一个个小房间似的。
每个小格子里都预先准备好了特殊的东西。
然后啊，会加入一些试剂，这些试剂就像是一群特殊的小侦探。
如果血液里有乙型肝炎表面抗原，那这些小侦探就会和抗原紧紧抱在一起，就像多年没见的老朋友一样。
这时候呢，就会发生一些奇妙的化学反应，会产生颜色变化。
如果颜色变得比较深，那就说明很可能有乙型肝炎表面抗原存在啦。
还有一种方法是化学发光免疫分析。
这就更有趣了，就像是在微观世界里放烟花。
同样是先取病人的血液，不过这个检测过程就像是在一个超级精密的小舞台上表演。
那些特殊的试剂和血液里可能存在的抗原结合之后呢，会产生一种发光的现象。
就像星星在小瓶子里闪烁一样，仪器会检测这个光的强度。
光越强，就表示乙型肝炎表面抗原的含量可能越高。
大刘说他当时在医院陪着亲戚的时候，眼睛就死死盯着那些检测仪器，心里就盼着能有个好结果。
他看着那些医护人员有条不紊地操作着，心里既紧张又好奇。
那些医护人员就像是微观世界的探险家，小心翼翼地摆弄着那些装着血液样本的小容器。
像金标法这种测定方法也很实用呢。
这个就有点像那种简易版的检测。
比如说有一种检测试纸，就像我们测怀孕用的试纸似的。
把血液滴在试纸上的特定位置，然后等一会儿。
ELISA法检测乙肝表面抗原实验精密度研究摘要】目的探讨ELISA法检测HBsAg实验精密度的影响因素及实验精密度对检验结果的影响。
方法检测卫生部临检中心0.5ng/mL质控血清，计算精密度；比较手工操作与全自动酶免分析仪法检测的精密度；检测不同效价的阳性血清，比较精密度，并作统计学分析。
结果临界值附近的标本可能引起误判，手工操作与全自动酶免分析仪法检测实验精密度差异有统计学意义(ｔ=4.72，Ｐ<0.01)。
结论实验精密度的高低对酶免法检测HBsAg实验存在影响，检验结果的判定应设置灰区并进行复检或进一步检测。
【关键词】乙型肝炎表面抗原 ELISA法检测一前言乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏性损害，是我国当前最广泛、危害最严重的一种传染病。
经济发展的水平较底，卫生条件比较差是本病流行的基础。
本病遍及全球，乙肝表面抗原携带率，热带地区高于温带，男性高于女性，在未经免疫预防的国家里，儿童携带率高于成人，城市高于农村。
传染源主要是患者及乙肝病毒无症状携带者、经血液、性接触和生活密切接触都是传播的重要方式。
易感者感染乙肝病毒后约经三个月（6周至6个月）发病。
临床表现为、食欲减退、恶性、呕吐、厌油、腹泻及腹章涨，部分病人有发人发热、黄疸，约有半数患者起病隐匿，在查体中发现。
肝功能异常，血清乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒脱氧合糖核酸（HBVDNA）、乙肝病毒免疫球蛋白M(HBVIgM)、脱氧核糖核酸聚合酶均为阳性。
大部分乙肝病人经治疗后临床症状能消退，少数病程迁延或转为慢性，其中一部分可发展为肝炎后肝硬变甚至肝癌;及少数病人病程发展迅猛，肝细胞出现大片坏死，成为重型肝炎；另有一些肝炎感染者则成为无症状的病毒携带者。
实验研究表明，乙肝表面抗原（HBsAg）与乙型肝炎的发生有着密切的关系。
因为它是HBV的外壳蛋白，本身虽然不具有传染性，但它的出现常常伴随着HBV的存在，所以它是人体已经感染上HBV的标志。
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。
结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml，低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。
结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。
关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析方法学验证前言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。
随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。
ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。
1. 材料与方法1.1 试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
1.2 仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。
1.3 方法1.3.1．溶液配置1×PBS缓冲液的配置：称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。
标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/ml。
取6个2mlEP管，分别标记为S1-S6。
50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul备用，按照下表稀释方案进行稀释。
表1 标准品的稀释方案质控品的配置：50ul/well, 共5复孔需250ul，配置300ul备用，取3个2 mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，按照下表稀释方案进行稀释。
表2 质控品的稀释方案1.3.2．铺板方案取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按照下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul。
空白对照加入1×PBS缓冲液。
表3 铺板方案1.3.3．加样步骤加入酶标抗体，50 ul/well，震荡。
37℃电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次，加入A、B液, 50 ul/ well，37℃电热恒温培养箱温育15 min。
加入终止液，50 ul/ well。
酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开Micr oplate Manager 5.2软件，选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT 和报告模式，测定各孔吸收值。
2. 结果2.1 标准曲线与线性范围标准品理论浓度对应的实测OD值表4 实测OD值以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.9973，显示具有良好的相关性Absorbance(OD)Conc(ng/ml)图1 线性关系图2.2 准确度（回收率）的验证质控品理论稀释浓度对应实测浓度值表5 实测浓度值质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个浓度梯度进行准确度（回收率）的验证。
表6 准确度的验证结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%，113.07%，满足限度要求在85%-115%的范围内，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为80.56%，满足方法定量限在80%-120%的范围内。
3个浓度梯度的平均回收率为97.7%，显示准确性好。
2.3精密度的验证2.3.1 板内精密度的验证上表中RSD(%)这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数CV值，HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准。
而3ng/ml,和1.5 ng/ml的变异系数CV为3.5%，3.7%，符合显示孔间重复性好，符合ng/ml级RS D水平的一般应<15%的要求，精密度高。
2.3.2 板间精密度的验证从同一实验室中获取2组同样的数据，做板间精密度的验证。
首先对同一实验条件下不同实验人员所获得的数据是否可用于板间分析做验证。
表8 板间精密度的验证以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系。
Absorbance(OD)Conc(ng/ml)图2 线性关系曲线以上标准曲线结果显示第二组数据的R2 =0.967，第三组数据R2 =0.991。
第二组数据由于有一些孔与标准曲线偏离较大，但考虑到随机抽样与均数存在一定误差，还是可以用于统计学分析。
下表对3组数据做板间分析。
从表中3个组的数据比较可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分别为9.1 0%，12.06%，满足对ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，精密度高。
而HBs Ag 1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不是很高，故以下对HBsAg理论浓度为1.5 ng/ml的三组数据做分析。
对HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的准确性，精密度分析表9 精密度分析从上表可知第一组数据和第三组数据准确性差，精密度高。
而第二组数据准确性高，而精密度相对于第一组和第三组数据要好。
综上对于HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的这一低浓度梯度的板内准确性和板间精密度相对于高浓度的线性要差一些。
2.4 检测限（LOD）计算LOD为取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。
表10 空白孔的OD值由上表可知，LOD为0.172。
检测限（LOD）表示分析方法检测低浓度样品的能力，也称为方法的灵敏度，LOD通常为标准曲线上的最低浓度点，要求标准曲线上的最低浓度点应>LOD，此标准曲线上最低浓度点为0.25，大于LOD（0.172），故此标准曲线线性好。
3. 讨论3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。
但随着临床医学的发展，乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。
随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。
而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据。
这在目前的临床治疗中应用十分广泛。
3.2 常用定量分析方法此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证，而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又称解离增强镧系荧光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。
此技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法【3】。
全自动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度【4】，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。
3.3 方法概述目前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。
以避免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【5】。
本次实验是对实验室的一种试剂盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。
往预先包被HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。
颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。
应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。
选择最低浓度为0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml ～600ug/ml之间，高者可达2000ug／ml以上【6】，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。
3.4 方法学验证内容方法学验证内容一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。
标准曲线亦称校正曲线，系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的相关性，通常用回归分析方法所得的回归方程来评件，此实验所用了6个浓度点建立标准曲线。
方法准确度指待测浓度与真实浓度的接近值了，一般用相对回收率表示，限度要求在8 5%—115%的范围内。
精密度则表示分析方法的可重复性，是对同一样品每次测定结果的一致性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于ug/ml级水平的相对标准偏差一般应<10%, ng/ml级水平的相对标准偏差一般应<15%。
检测限则表示分析低浓度样品的能力，通常又称为灵敏度。
3.5 结果分析及应用评价第一组数据标准曲线R2=0.9973，显示具有良好的相关性，HBsAg 浓度为6 ng/ml和3ng/ml 的回收率分别为为97.58%，符合113.07%，符合限度要求在85%—115%的范围内。
但是HBsAg 浓度为.5ng/ml的回收率为80.56%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度差。
