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蛋白提取常见问题分析

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蛋白提取常见问题分析Q：如何进行组织液氮研磨？A：将组织块在液氮里冻实，敲成大小合适的小块后放在研钵里，倒液氮，边研边加，保持研钵里有液氮，或是保持组织块不融。

研碎了就行了。

注意做前研钵等器具要预冷，用液氮或是先放负二十冰箱一段时间。

注意事项：1.液氮研磨的研钵，药勺必须预冷。

2.开始研磨前，将研钵置于冰袋上，并加入少量的液氮，快速将样品转入其中。

3.继续加入液氮，快速捣碎样品，然后快速研磨。

4.待液氮挥发完前，继续加入液氮，快速淹没，重复操作，待样品变成非常细小的白色干粉时即可。

5.将干粉刮下转入裂解液中，再加裂解液于研钵中，将其中的黏附的样品洗下。

整个过程保持样品处于温度低的环境，研磨的速度要快而有力度。

这样才能破碎细胞，同时不降解蛋白。

Q：提取蛋白Western内参如何选择？A：参照下表选择：适用范围 内参名称 分子量大小 注意事项胞浆蛋白和总蛋白 beta-actin 43 kDa 不适用于骨骼肌样品，细胞生长条件的改变和细胞外基质成分的相互作用可能会改变肌动蛋白的合成胞浆蛋白和总蛋白 GAPDH 30-40 kDa 一些生理因素例如缺氧症和糖尿病会增强 GAPDH 在特定细胞中的表达胞浆蛋白和总蛋白 Tubulin 微管蛋白 55 kDa 微管蛋白的表达随着抗菌和抗有丝分裂抗性药物而改变核蛋白 TBP（TATA box binding protein）38 kDa 不适用于除去 DNA 的样本 核蛋白 Lamin A74 kDa核蛋白 Lamin B核纤层蛋白72 kDa 不适用于除去核膜的样本 核蛋白 Histon H3膜蛋白 α-Tubulin55 kDa膜蛋白 Na-K ATPase植物内参 Rubisco核酮糖二磷酸羧化酶Lhcb4多抗当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H)，或者核纤层蛋白(nuclear lamina protein)等为核内参抗体。

除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。

但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。

反之，组蛋白Histone H2A.X 及Histone H3.1等由于是染色体的组成型表达组分，表达比较稳定，经常被作为最广泛的核内参使用。

Q：膜蛋白不溶于loading buffer，或者煮沸后形成沉淀怎么办？A：用60度变性1h；如果还是不行，把loading buffer的SDS换成LDS。

Q：多少细胞提的蛋白够做western blot？A：一般5×106足够。

但要看是哪种细胞，有的细胞的体积就很小，而有的细胞则铺得很开。

常规做WB一个孔道上样要105个细胞。

但也和目的蛋白及提取的方式有关。

如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。

Q：同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？A：可以，甚至可以同时测十几种样品。

Q：蛋白提取后可以存放多久？A：－80℃，一年没有问题。

关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌污染Q：提取蛋白后做WB一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？A：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。

开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。

要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

所以拿到好的结果不容易。

Q：做组织样品蛋白的western的时候，提取蛋白有什么特别注意的吗？A：必须进行研磨、匀浆处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail）。

Q：蛋白电泳胶浓度如何选择？A：参照下表选择胶浓度蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×105 10-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5Q：提取的蛋白选用何种方法定量？A：提取的样品中若含有去垢剂则需要选用BCA法进行蛋白浓度测定，若样品中含有螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类等，则需要选用Bradford法进行蛋白浓度测定。

Q：用组蛋白H3作为核蛋白的内参,结果没出现条带，目的蛋白有条带？A：组蛋白与DNA结合紧密,需进行超声剪切DNA,不然得到的信号很弱。

可以试试将常规所取上清留下的沉淀用loading buffer重悬,然后用超声剪切试试,上样对比一下,组蛋白应该在沉淀中。

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植物核蛋白提取(蛋白组实验,质谱适用)

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邮箱：bestbio@ 电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
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植物核蛋白提取试剂盒
（蛋白质组学实验适用）
货号：BB-319906
V1.7.0
试剂盒储存条件： 2-8℃保存。
开盖后组份按要求条件保存。
试剂盒组成：
产品组成
BB-319906-1
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组份编号
规格
50 assays
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试剂 A：植物核蛋白提取液 A
100ml

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本试剂盒采用非酶法提取，提取过程简单方便，速度快，可在 1 小时内完成，而且绝少 交叉污染，但是蛋白回收率相比酶法较低。酶法提取制备的蛋白，回收率稍有提高，蛋白纯 度高，保持天然活性，但是耗时较长。如果需要更加快捷的提取试剂盒，可以选择非酶法的 提取试剂盒，对提取速度没有要求的话，可以选择酶法提取试剂盒（相关产品 BB-319910）。 请根据实际需要选择试剂盒。
产品号 BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3126 BB-3105 BB-3702 BB-3181 BB-3183 BB-3187
His-Tag表达蛋白纯化原理、方法和问题分析

His-Tag表达蛋白纯化原理、方法和问题分析

组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。

同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。

市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。

WB常见问题解答

WB常见问题解答

Western Blot常见问题及处理(一)1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。

方便，特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起，再转移。

其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。

这是最主要的。

同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。

7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。

将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。

10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。

蛋白不表达常见原因及分析

蛋白不表达常见原因及分析

蛋白不表达常见原因及分析在生物学和医学研究中，蛋白表达是一个至关重要的环节。

然而，经常会遇到蛋白不表达的情况，这给研究工作带来了很大的困扰。

要解决蛋白不表达的问题，首先需要了解导致这一现象的常见原因。

一、基因层面的问题1、基因序列错误基因在转录和翻译过程中，需要遵循严格的碱基互补配对原则。

如果基因序列本身存在错误，比如碱基的缺失、插入或突变，就可能导致 mRNA 无法正确合成，或者合成的 mRNA 无法翻译成有功能的蛋白质。

2、基因调控元件异常基因的表达受到多种调控元件的控制，如启动子、增强子、沉默子等。

如果这些调控元件发生突变或缺失，可能会影响基因的转录起始效率，导致蛋白表达水平降低甚至不表达。

3、基因拷贝数不足在某些情况下，基因的拷贝数过低会导致转录产生的 mRNA 量不足，从而无法合成足够的蛋白质。

二、转录层面的问题1、 RNA 聚合酶活性受影响RNA 聚合酶负责将 DNA 转录为 mRNA，如果其活性受到抑制或者出现功能障碍，就会影响 mRNA 的合成，进而导致蛋白不表达。

2、转录因子异常转录因子能够与基因的调控元件结合，促进或抑制基因的转录。

当转录因子的表达水平、活性或与调控元件的结合能力出现异常时，可能会影响基因的正常转录。

三、翻译层面的问题1、密码子偏好性不同的生物体对某些密码子的使用频率存在差异。

如果在表达系统中使用了不常用的密码子，可能会导致翻译效率低下甚至停滞，从而造成蛋白不表达。

2、 tRNA 丰度不足tRNA 负责携带氨基酸参与蛋白质的合成。

如果某些特定 tRNA 的丰度不足，无法及时供应相应的氨基酸，就会影响蛋白质的翻译进程。

3、核糖体结合位点问题核糖体需要结合在 mRNA 上的特定位点才能启动翻译。

如果核糖体结合位点的序列发生突变或缺失，核糖体无法有效结合，蛋白合成也会受到阻碍。

四、蛋白折叠与修饰问题1、错误折叠即使蛋白质成功合成，若折叠过程出现错误，形成的错误构象可能会被细胞内的质量控制系统识别并降解，导致蛋白无法积累。