关于内参基因的选择

内参基因使用方法
内参基因是在分子生物学和基因表达研究中常用的实验技术。

它是一种可以用作对比和标准化基因表达水平的参考基因。

以下是内参基因的使用方法。

首先，选择一个合适的内参基因。

内参基因应该具有以下特征：在不同样本中表达稳定，不受研究条件的影响，并且其表达水平与感兴趣的基因相对稳定。

常用的内参基因包括β-actin、GAPDH和18S rRNA等。

其次，设计合适的实验方案。

确定研究目的和实验条件，并选择适当的实验方法。

例如，可以使用实时定量PCR（qPCR）技术来测量内参基因和感兴趣的基因的表达水平。

接下来，实施实验。

收集样本，并提取RNA或DNA。

使用逆转录酶将RNA 转录成cDNA，然后用qPCR技术测量内参基因和感兴趣基因的表达水平。

在实验过程中，应该设置技术重复和生物重复来保证实验结果的可靠性。

最后，分析实验结果。

使用合适的统计方法对实验数据进行分析，比较不同样本中内参基因和感兴趣基因的表达水平。

根据实验结果，可以确定内参基因的表达水平，并将其用作标准化感兴趣基因的表达水平。

需要注意的是，在使用内参基因时，应该选择多个内参基因进行验证，以确保结果的可靠性。

此外，内参基因的选择应该根据研究对象和实验条件进行优化，并与其他研究结果进行比较。

总结一下，内参基因是基因表达研究中常用的参考基因。

通过选择合适的内参基因、设计合理的实验方案、实施实验和分析实验结果，可以准确使用内参基因来标准化和对比感兴趣基因的表达水平。

这种方法有助于我们更深入地了解基因的功能和调控机制。

拟使用软件：geNorm NormFinder BestKeeper
拟使用的内参基因：如3一磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、肌动蛋白基因(actin)、微管蛋白基因ftubulin)、18S核糖体RNA(18SrRNA)、40S核糖体蛋白S3A(40S ribosomal protein S3A,WS21)、多聚泛素酶基因(ubiquitin)，β-肌动蛋白基因(β-actin)和α-微管蛋白基因（α-aubulin）、ldh（L-lactate dehydrogenase）、rpoB（DNA-directed RNA polymerase subunit beta）、gapdh (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、recA （Recombinase A）、16S rRNA （16S ribosomal RNA）。

实验数据：
1 总RNA的质量（电泳，浓度，纯度）总RNA的完整性通过2．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳槽用O．5 M NaOH浸泡20 min去除RNase，去除DNA后进行PCR(40个循环)验证是否有DNA污染。

2 关系数(R2)、解链温度（Tm值）。

3 扩增效率（E）与标准曲线的斜率(slope)相关，计算方程式为：E=(10-I/slope-1)×100。

4 对pH、温度、盐含量、的响应。

内参基因摘要：内参基因是一类在基因表达研究中被广泛应用的基因，它们在细胞中的表达不受外界条件和实验干扰的影响，并在分析基因表达水平时被用作参照基因。

本文将介绍内参基因的定义、特点和选择方法，并讨论其在基因表达研究中的重要性和应用前景。

第一部分：引言内参基因是指在特定细胞或组织中表达稳定且没有明显变化的基因，它们的表达水平被广泛应用于基因表达研究的标准化和比较。

与实验条件和处理无关，内参基因在基因表达分析过程中能提供一个相对稳定的参照点，从而减小实验误差。

在过去的几十年中，内参基因已成为基因表达研究中不可或缺的重要因素。

第二部分：内参基因的特点1. 表达稳定性：内参基因的表达水平相对稳定，不受外界条件和实验干扰的影响。

这使得内参基因成为一个可靠的参照标准。

2. 丰度适中：内参基因的表达水平应适中，既不能太高，也不能太低。

如果表达水平过高，会导致内参基因的扩增曲线过早饱和，影响定量结果的准确性。

3. 表达均匀性：内参基因的表达在不同样本中应该是均匀的。

这意味着在不同组织或条件下，内参基因的表达水平不会发生明显的变化。

第三部分：内参基因的选择方法内参基因的选择是基因表达研究中的一个关键环节。

目前常用的方法包括基于文献综述、生物信息学分析和实验验证等。

以下是一些常用的内参基因选择方法：1. 综合评估：通过综合考虑内参基因的表达稳定性、丰度适中性和表达均匀性等因素，从候选基因中筛选出最适合的内参基因。

2. 基因表达稳定性分析：利用统计学方法，比较多个候选内参基因的表达数据，选取具有最小变异的基因作为内参基因。

3. 基因表达数据库：利用公开的基因表达数据库，比如GEO数据库和TCGA数据库，分析不同基因在不同样本中的表达水平，选择表达稳定的基因作为内参基因。

4. 实验验证：通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或实时定量PCR等技术，验证候选基因的表达稳定性和适用性。

第四部分：内参基因的应用前景内参基因在基因表达研究中的应用前景广阔。

中国农业科技导报,2009,11(6):30-36Journa l o f Ag ricu ltura l Sc ience and T echno l ogy收稿日期:2009-03-25;修回日期:2009-10-28基金项目:国家863计划项目(2006AA10A111,2007AA10Z119);国家转基因重大专项(2008ZX0809-001);/十一五0国家科技支撑计划项目(2007BAD59B02)资助。

作者简介:胡瑞波,博士研究生,研究方向为植物发育分子生物学。

E-m ai:l rayhu@yahoo .cn 。

通讯作者:傅永福,研究员,主要研究方向为植物发育分子生物学。

Te:l 010-********;E -ma i :l f u f u19c n@163.co m植物实时荧光定量PCR 内参基因的选择胡瑞波, 范成明, 傅永福(中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081)摘 要:实时荧光定量RT-PCR (rea -l ti m e quantitati ve reverse transcripti on PCR,qRT-PCR )具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。

常规q RT-PCR 采用相对定量进行分析,其关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。

持家基因被广泛用作内参基因,但在所有生理条件下均稳定表达的理想内参基因并不存在。

大多数传统内参基因已不能满足qRT-PCR 准确定量的要求。

基于基因芯片表达数据和EST 数据库并结合qRT-PCR,可以筛选稳定性好的新的内参基因。

简要综述了植物qRT-PCR 内参基因的研究进展,并就内参基因的选择中应注意的问题进行了探讨。

关键词:实时荧光定量RT -PCR;内参基因;ge N o r m;基因表达中图分类号:Q 789 文献标识码:A 文章编号:1008-0864(2009)06-0030-07R eference G ene Selecti on i n P l ant R ea-l ti m e QuantitativeR everse Transcri pti on PCR (q RT -PCR )HU Ru-i bo ,FAN Cheng -m i n g ,F U Yong -fu(Instit u t e of C rop Science ,N ati on alKey Facilit y of C rop Gen e Res ou rce and Genetic I m prove m en t ,Ch i n ese Acade m y ofAgricultura lS ci en ces ,B eiji ng 100081,Ch i na)Abstract :R ea-l ti m e quantitati v e RT-PCR (q RT-PCR )techno l ogy ,w ith quantitati ve accuracy ,h i gh sens i tiv it y andhi gh -throughput character i sti cs ,has been w i de l y used in gene expression analysis .Based on t he re l a tive quan tita ti ve ana l ys i s ,q RT-PCR data must be norma li zed w ith one o r mo re proper and stab le i n ternal reference genes .H ouse -keepi ng genes are custo m ar il y used as endogenous references for re lati ve quan tificati on .But no t a si ng le g ene can act as a un i v ersal reference reported so far .M ost o f the trad iti ona l housekeepi ng genes a re unab le to ensure accurate norma li zati on i n q RT-PCR.Based on t he trem endous gene -chip expressi on da ta and public deposited EST data ,ne w reference genes w ith superior stab ilit y w ere selected and ver ifi ed w ith q RT-PCR.T he research progress of reference genes in plant q RT-PCR w as rev ie w ed and aspects t o be consi dered i n f u t ure reference gene se lecti on were a lso discussed .K ey words :rea-l ti m e quanti tati ve reverse transcr i pti on PCR;reference genes ;ge N o r m;gene expression实时荧光定量RT-PCR (rea-l ti m e quantitative reverse transcri p ti o n PCR,qRT-PC R )是在传统PCR 技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术,具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析[1,2]。

内参基因筛选方法
内参基因是指在细胞或组织中表达稳定、不受外部刺激影响、对于生物体正常生长发育至关重要的基因。

内参基因的表达量在分子生物学研究中常被用作参考，因为它们在不同样本中的表达量应该是相同的。

然而，在进行基因表达定量时，应选用适当的内参基因，否则可能会导致结果偏差。

因此，内参基因筛选方法是分子生物学研究中的重要步骤之一。

目前，内参基因的筛选方法主要包括三种：文献综述法、基因芯片法和实时荧光定量PCR法。

文献综述法是指通过文献调研，选择已有研究证实表达稳定、适合做内参基因的基因。

这种方法的优点是简单快捷，但缺点是容易出现结果偏差，因为不同实验条件下内参基因的选择可能不同。

基因芯片法是指利用基因芯片技术，同时检测多个基因的表达量，然后利用统计学方法筛选出表达稳定的内参基因。

这种方法的优点是高通量、准确性高，但缺点是成本较高，同时需要非常严格的数据分析方法。

实时荧光定量PCR法是指利用实时荧光定量PCR技术，同时检测多个基因的表达量，然后利用统计学方法筛选出表达稳定的内参基因。

这种方法的优点是准确性高、成本低，且操作简单。

缺点是只能同时检测有限数量的基因。

综上所述，内参基因筛选方法的选择应根据实验设计、设备条件等多个因素综合考虑。

无论采用何种方法，都应该进行严格的数据分
析和统计学处理，以确保得到准确、可靠的结果。

选择内参基因的原则日期：2012-05-03来源：未知作者：周慕云点击：次相关专题PCR内参：选还是不选？我们在做PCR的时候经常会遇见一些问题，比如说目的基因条带没有P出来。

所以在试验中往往要用到一些在细胞内稳定表达的基因来作为参照，来使实验组的数据更有说服力，也更能快速的找到实验失败的问题所在。

做相对定量的real-time PCR遇到如下问题：实验组和对照组内参基因(如β-actin或GAPDH) 的CT不一致如何判断，这种不一致到底是由于初始cDNA拷贝数不一致导致的，还是由于内参基因受到处理因素影响，从而发生变化导致的?举个例子，A组为对照组大鼠，B、C、D组为实验组大鼠选用β-actin作为内参基因，进行预实验，A、B、C、D四个组各取3只老鼠的cDNA(同一组内3个生物学重复)，每个样本有三个复孔(3个操作平行)，计算β-actin CT值的均值，发现A、B、C、D四个组的CT值均值分别为16.2，18.2，17.5，17.8;我是应该换一个内参基因，使其在四组间CT均值保持一致?(万一换了还是不一致呢?)还是应该将CT低的样本的cDNA进行稀释，如将A组cDNA稀释100倍，这样理论上来说，其β-actin的Ct均值应该就增大了2;有高手说可以用多个看家基因结合的方法，来进行相对定量，但具体是怎么操作的呢?答：首先先要确定处理后不发生变化的内参基因。

可以搞个试剂盒，如takara的，有一系列的house keeping gene的primer，先做一次实验，比较这些内参基因中，哪些是不受你的处理因素影响的。

挑选合适的内参基因。

然后就是做下一步的实验了，你说是做相对定量，那么首先要做目的基因和内参基因的标准曲线，确定扩增效率是否一致，不一致的话，就考虑用双标准曲线法啦。

你说你的实验组和对照组内参基因(如β-actin或GAPDH) 的CT不一致，这个很正常啊，你最后的结果是要通过将目的基因和内参基因的比值来获得的。

DOI:10.13275/ki.lykxyj.2021.01.017福建柏实时荧光定量PCR 内参基因的选择周成城1，荣俊冬2，谢德金2，杨德明2，何天友1，郑郁善1,2*(1. 福建农林大学园林学院，福建 福州　350002；2. 福建农林大学林学院，福建 福州　350002)摘要：[目的]筛选稳定的内参基因，用于福建柏不同组织部位荧光定量PCR 分析。

[方法]基于福建柏转录组数据，以福建柏的根、皮和鳞叶为材料，设置5个浓度梯度（0.32、1.6、8、40、200 ng·μL −1）的各组织cDNA 混样作为模板，选择ACT7、UBQ 、EF2、CACs 、TIP41、UBC2b 、RH8、GAPDH 8个基因作为候选内参基因。

利用实时荧光定量PCR 技术并结合geNorm 、Normfinder 和 BestKeeper 等软件对候选内参基因的表达稳定性进行评价。

选择评价结果中较为稳定的候选基因作为内参基因，通过分析4个萜类合成酶基因（FhTPS1、FhTPS2、FhTPS3、FhTPS4）在福建柏不同组织部位的相对表达情况，对候选内参基因的稳定性进行验证。

[结果]geNorm 、Normfinder 和 BestKeeper 分析结果均表明: 不同质量浓度福建柏各组织cDNA 混合样品中，最稳定的内参基因是UBC2b 和ACT7。

荧光定量PCR 分析表明，候选内参基因ACT7和UBC2b 在福建柏不同组织部位中表达稳定。

4个目的基因的相对表达量在福建柏根、皮和鳞叶中均有所不同，FhTPS1基因在根中相对表达量最高，FhTPS2和FhTPS4在鳞叶中相对表达量最高，FhTPS3在皮中相对表达量最高。

[结论]8个候选内参基因中，ACT7与 UBC2b 稳定表达且不受cDNA 质量浓度变化影响，二者的组合能够实现稳定归一化并提高定量分析结果准确性，适合作为福建柏各组织部位荧光定量表达分析的理想内参基因。

在相对定量中，内参基因的选择是非常关键的一步，因为它的表达量通常保持相对稳定，不会受到实验条件或因素变化的影响。

内参基因的选择通常取决于你的样本类型和实验设计。

通常可以选择β-actin、GAPDH、18S rRNA等作为内参基因。

对于内参基因的引物设计，需要注意以下几点：
1. 引物长度和GC含量：引物长度通常在18-27bp之间，GC含量在40%-60%之间。

过长或过短的引物可能导致引物自身折叠或与非特异性模板结合，影响扩增效率。

2. 引物碱基：避免使用嘌呤（A）嘧啶（T）单链互补序列，以减少引物二聚体形成和非特异性扩增。

同时，应避免使用三级结构中的特定碱基序列，以减少非特异性扩增。

3. 引物设计原则：引物设计时应该考虑退火温度，考虑上下游引物的最佳互补区域。

避免使用邻近的GC四联体，以防止形成引物二聚体，降低引物的特异性。

在靠近3'端的碱基处选择能提高PCR扩增效率的碱基。

同时考虑引物二级结构的形成，以免影响扩增效率。

至于具体的设计步骤，一般包括以下步骤：
1. 根据内参基因的序列信息设计一对特异性引物。

2. 优化引物的长度、GC含量、退火温度等参数，确保引物的特异性。

3. 进行引物特异性验证，可以使用不同来源的样品进行预实验，观察特异性扩增情况。

4. 根据实验需求和样品性质，调整引物浓度和其他实验参数，进行后续实验分析。

以上信息仅供参考，如需了解更多信息，请查阅相关文献资料或咨询专业人士。