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优质课腐札的制作一、腐乳制作得原理与实验设计•1、腐乳制作参与发酵得菌种•在豆腐得发酵过程中，有许多种微生物参与,如青霉、—、哄、毛霉等，其中起主要作用得就是吨霉就是一种丝状真菌（真核生物），分布广泛常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上2.腐乳制作的原理蛋白质毛霉等微生物产告的小分子得肽、氨基畛蛋白酶-------°脂肪厕匣甘油、脂肪酸思考：1、您能利用所学得生物学知识，解释豆腐长白毛就是怎么一回事？答:豆腐上生长得白毛就是毛霉得白色菌丝@严格地说就是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝Q2、王致与为什么要撒许多盐，将长毛得豆腐腌起来?答:盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败.3、为什么腐乳“闻着臭，吃着香”？豆腐在微生物得作用下，蛋白酶把蛋白质分解成小分子肽与氨基酸,脂肪酶把脂肪分解成甘油与脂肪酸，并形成具有芳香气味得物质，故“吃着香”；细菌发酵时产生有臭气得含硫化合物，故“闻着臭”！、实验设计出毛霉温度保持在15-18°C,并保持一定得湿度;豆腐水分控制在70%左右。
思考:发酵得温度为什么保持15-18°C?邮度不适于绸菌，酵母菌与曲霉得生长,Wf毛霉慢慢生长。
思考:我们平常吃得豆腐，哪种适合用来做腐乳？原因?含水量为7Q%左看得豆腐适于作腐乳°用含水量过高得豆腐制腐乳，不易成形。
思考：吃腐乳时，您会发现腐乳外部有一层致密得“皮”。
这层“皮”就是怎样形成得呢？它对人体有害吗？它得作用就是什么七®就是前期发酵时在豆腐表面上生长得菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳得W，使腐乳成形.W"体无害Q思考:毛霉夙哪来呢？自然条件下4霉来自于空气中得毛霉抱子，球代得腐乳生成就是在严格无菌得"下，将优良得毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免财菌种啪染,保涯产品得质量.、实验设计让豆腐上长将豆腐放在笼屉内温度保持在15.出毛霉18°C,并保持一定得湿度;豆腐水分---------------控制在70%左右。
腐乳中毛霉的分离筛选及工业育种摘要：对自然界分离纯化工业生产腐乳用毛霉技术进行了综述，并概括了工业发酵中毛霉种子的扩培及菌种保质防衰退的方法，为工业生产腐乳提供了理论基础。
关键词：腐乳毛霉，分离纯化，工业育种，菌种保藏Fermented bean curd of mucor separation screening andbreeding industryAbstract:The nature purification industrial production fermented bean curd with mucor technology were summarized, and generalizes the industrial fermentation medium wool mildew seed expansion of the culture and culture quality and prevent the decline of the methods for industrial production of fermented bean curd provides a theoretical basis. Keywords:fermented bean curd mucor, separation and purification, industrial breeding, culture collection.0前言腐乳具有很好的营养功能,富含有机酸、醇、酯等风味物质；含有大量水解蛋白质、游离氨基酸、游离脂肪、碳水化合物、硫胺素、核黄素、烟酸、钙、磷等营养成分,不含胆固醇。
其中蛋白质含量高达12%-22%,而且18种氨酸齐全。
腐乳生产历史悠久,依据生产使用菌种不同可分为细菌型、根霉型和毛霉型。
目前,工业生产中运用最多的是毛霉,主要因其具有菌丛细长柔软,能包裹豆坯形成块状完整的腐乳;其酶系丰富,主要含有内肽酶和端肽酶的复合酶,水解蛋白质无苦味,且无毒无害、不产生怪味和异色等。
食品微生物学试验技术课程试验报告姓名：方菊班级：10食品科学与工程学号：201024103237试验名称：毛霉的分离和豆腐乳的制备一.目的1.学习毛霉的分离和纯化方法。
2.掌握豆腐乳发酵的工艺过程。
3.观察豆腐乳发酵过程中的变化。
二.原理豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。
民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。
豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。
（一）毛霉腐乳：以豆腐坯培养毛霉，进行发酵，使白色菌丝长满豆腐坯表面，形成坚韧皮膜，积累蛋白酶，为腌制装坛后期发酵创造条件。
（二）毛霉的特性及一些性能：1.毛霉的繁殖方式是孢子繁殖，其新陈代谢类型是异样需氧型。
孢子囊孢子（内生孢子）→种→曲种（或称种曲，目的：获取大量生命力强的孢子，干燥后保存生产）2.菌落形态：白色，乳白色或奶黄色的棉絮状3.具有较强分解蛋白质的能力（因为能长生丰富的蛋白酶）。
4.菌丝形态：菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。
菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。
各分枝顶端着生球形孢子囊，内有形状各异的囊轴，但无囊托。
囊内产大量球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子。
三.材料1.菌种：毛霉斜面菌种。
2.培养基（料）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），无菌水、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐3.仪器和器具培养皿、500mL三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。
四.流程毛霉斜面菌种→扩大培养→孢子悬浮液↓豆腐→豆腐坯→接种→培养→晾花→加盐→腌坯→装瓶→后熟→成品1.毛霉的分离配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检。
豆腐乳毛霉干粉菌剂的研制摘要本论文主要进行了以下几方面的研究工作：首先，研究了中国传统腐乳酿造中的毛霉酿造工艺，并且进一步研究了使用纯菌种发酵与传统自然接种发酵之间的差异。
第二，研究了腐乳菌种Z328及其前酵条件。
Z328属于放射毛霉属，最适生长温度28℃，pH5~6，相对湿度96~97%。
第三，研究了毛霉发酵型腐乳的风味产生机理。
腐乳中的鲜味物质主要是氨基酸，毛霉在豆腐坯表面生长时，在豆腐坯表面形成坚韧的皮膜，并产生大量的蛋白酶，蛋白酶对豆腐坯中的蛋白质进行分解产生氨基酸，成为豆腐乳中的主要风味物质。
第四，研究了毛霉菌种的扩大培养及其中的无菌操作。
第五，研究了冷冻干燥法制作毛霉干粉菌种的工艺流程。
最后，对毛霉干粉菌剂的使用方法进行了研究，并进行了腐乳的生产实验。
关键词：腐乳，毛霉，发酵，酿造，蛋白酶，干粉菌种Development on the Powder culture of Sufu MucorABSTRACTThe thesis’s major rusearch tasks are as follows:Firstly, the traditional technology of SOFU production in china was invested,and the differences between the tradition technology and the new technology that ferments with pure Mucor.were also mentioned.Secondly,Mucor sufu Z328 and the conditions for the strain Z328 were at pH5~6,temperature28℃,relative humidity96~97%.Thirdly,researched the flavor constituent in SOFU,the amino acide formed by Mucor is the major flavor factor of SOFU.While the Mucor growing on the TOFU curd ,it produced protein enzyme,which converse protein into amino acide.Fourthly,practiced the extention development of Mucor,and reviewed the operation without germ.Fifthly,practiced the refrigeration dehydration used in pure Mucor production.At last,I practiced the producation of SOFU with dehydrated pure Mucor togain the usage of pure Mucor.KEYWORDS:SOFU,Mucor,Z328,protein enzyme,amino acide ,refrigeration dehydration.目录摘要 (I)The Development of Powder SOFU Mucor (II)ABSTRACT (II)目录 (III)第一章绪论 (1)1.1豆腐乳生产的发展及现状 (1)1.2豆腐乳的分类 (2)1.3 豆腐乳的酿造机理及主要风味物质 (3)1.4 豆腐乳消费水平及前景 (4)1.5豆腐乳的营养保健功能 (4)1.6 本论文的主要研究内容 (5)第二章 Z328的扩大培养及菌种的保藏 (6)2.1 引子 (6)2.2 实验材料及设备 (6)2.2.2 实验设备 (6)2.3 Z328扩大培养的实验方法 (6)2.3.2 三角瓶培养基的灭菌 (6)2.3.3 三角瓶麸皮培养基的接种 (7)2.5 结果与讨论 (9)2.6 本章小结 (9)第三章冷冻干燥法制取Z328干粉菌种 ...................... 错误！未定义书签。
咸亨腐乳生产工艺流程一、豆腐坯加工工艺流程1.大豆豆腐坯的质量优劣首先取决于大豆的品质。
咸亨腐乳大豆一般选择粒大、皮薄、蛋白质含量高的本地大豆，目前由于本地大豆产量限制，已确定东北榆林优质大豆做补充。
2.浸泡大豆淘洗后以清水浸泡，用水量约为大豆质量的3倍，浸泡时间因季节温度而有所调整，8到36小时不等，泡至大豆皮不轻易脱落，豆瓣掐之易断，断而无生心为度。
3.磨豆采用二磨三滤工艺，加水量约为大豆量的3倍，并加适量消泡剂。
4.过滤、煮浆三级过滤，采用连续煮浆器煮浆，出口温度控制在105-110℃。
5.点浆、蹲闹熟浆由管道通入豆腐缸内，打开盐卤阀，边搅动边加盐卤，加的量和搅拌的程度由师傅经验控制，不同品种的豆腐乳要求的凝聚状态不同。
6.压榨点浆后豆腐脑下沉，上部为澄清黄色泔水，将点好的豆浆放到铺好袱布的竹滤器上，包好，压以重物，将坯子水分控制在71%左右，同时，师傅经验在确定压榨终点时，也起重要作用。
7.划坯、冷却将压榨好的豆腐放到相应的划刀架上，对准划刀，切成需要的规格。
小块：2.4×2.4×1.6(cm) ，大块：3.0×3.0×1.8(cm)。
不符合要求的边皮打碎后加入到压榨前点好的豆浆中。
要求：豆腐坯方正，不破损，少边皮。
切好的豆腐坯凉至40℃以下时送入接种室。
二、菌种/制曲（毛霉）a.小方腐乳，毛霉种曲制作工艺流程。
*麸皮培养基为麸皮与水1：1.2，蒸汽灭菌后即成。
以上是新的方法，老式的方法是：麸皮拌面粉→蒸熟、灭菌→晾凉→拌入麸皮种（约1%）→常温发酵（堆积自产热）→待菌丝体长到微微发黄即可做为接种曲用。
b.大方腐乳（如红方，醩方）的接种菌液则采用如下工艺三、豆腐乳发酵及腌制工艺流程1.豆腐坯、接种豆腐坯送入接种室后，将切面朝下整齐摆放于镂空浅盘塑料箱中，间隔约2cm，然后均匀喷洒一层菌悬液或者曲面，交错叠放于发酵房。
2.培养发酵房温度控制在23-28℃，湿度75-85%，培养时间1-2天，待豆腐坯长成布满茂盛纯白毛霉菌丝的“毛坯”时结束培养。
优质腐乳毛霉生产种曲的制备摘要运用人工培养技术，通过单因素和正交试验，研究出毛霉生产种曲的最适培养条件，并在实际生产中进行大量检验，获得大量菌丝发育健壮、孢子数量多、杂菌污染少的毛霉种曲，进而制成孢子粉，从而提高菌种的保藏性能。
结果表明，优质腐乳毛霉生产种曲的最佳制备条件为使用1：9麸皮和豆渣作为培养基，湿度为70%，在25℃下培养48h，再采用45℃-50℃的干燥温度、80%干燥率制成孢子粉。
关键词腐乳毛霉；种曲；培养条件；孢子数1引言腐乳是中国具有民族风味的发酵食品，有1000多年的历史[1]。
它是用豆浆的凝乳状物经微生物发酵制成的一种十酪型产品，营养丰富，日感细腻风味独特，含有多种生理活性成分及保健功能[2]，深受海内外人民的喜爱，许多欧美地区的人称之为中国十酪( Chinese cheese) [3]。
自古以来，腐乳的生产遍布中国各地，但以浙江的绍兴、杭州、江苏的无锡、苏州广西的桂林、四川的五通桥最负盛名[4]。
20世纪50年代中期以来，由于搞清了发酵菌种的问题，腐乳的生产由自然接种逐渐转为人工接种，毛霉是人工接种法生产腐乳的主要菌种[5]。
在前期培菌过程中，将纯培养毛霉菌孢子制成的菌悬浮液或粉状菌种喷洒在豆腐坯上培养长毛，给腐乳一个良好的“体”，并分泌蛋白酶分解豆腐乳中的蛋白质，使产品具有良好的品味[6]。
种曲是腐乳前期发酵的种子，由毛霉逐步培养扩大而制得。
种曲质量的优劣，直接影响腐乳前期发酵的质量，是腐乳生产成败的关键因素之一。
酿造腐乳的质量与毛霉菌种有着密切关系，然而，毛霉的生长条件要求较高，需要较低的温度、较高的湿度和充足的氧气，另外，毛霉还容易自我降解、易感染杂菌，群体中的某些个体有关遗传基因易发生变异，菌种的生产性能会逐渐下降退化。
因此，必须控制菌种的传代次数，必须经常对生产菌种经常进行分离、复壮或诱变育种。
就目前现有腐乳生产厂使用的菌种来看，不太理想的占多数。
主要原因是：由于技术条件和设备条件有限，对现有菌种的分离、复壮、筛选及选育工作有一定难度，造成菌种老化、衰退、抵抗力差、酶系少、酶活低、腐乳成熟后质量不够理想[7]。
针对以上情况，本论文运用人工培养技术，以腐乳毛霉为菌种，通过单因素试验和正交实验，研究了培养条件与种曲生长的关系，着力于毛霉优质种曲的制备，以期获得大量菌丝发育健壮、孢子数量多、杂菌污染少并在生产时可以迅速适应白坯生长环境的毛霉种曲，为当地工厂的生产提供优良的生产菌种。
同时，试验还研究了种曲的干燥条件，将种曲进一步制成孢子粉，延长菌种的保存时间更好防止杂菌污染，并且在使用时可以迅速活化并适应工厂的生产环境。
2实验部分2.1实验材料2.1.1实验原料菌种：腐乳毛霉，由高要协和腐乳厂提供。
毛霉斜面培养基：PDA培养基。
三角瓶培养基：豆渣、麸皮、水等。
2.1.2实验仪器设备全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS SII）、洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2FD）、微电脑控制生化培养箱（广东医疗器械厂，LRH-150-Ⅱ）电热恒温干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司，DHG-9070B）电炉、酒精灯、接种钩、试管、250mL三角瓶、烧杯、500mL容量瓶、托盘等。
2.2菌种的分离纯化2.2.1PDA培养基的制备材料：去皮马铃薯：200g 葡萄糖：20g 琼脂：20g 自来水：1000mL制法：取无霉烂马铃薯，去皮，称量后切成小块，加水煮沸30min，用纱布过滤后加入葡萄糖和琼脂，融化后补足水分至1000mL。
冷却至60℃时进行分装，包扎标记后置于121℃中灭菌30min，取出摆斜面备用。
2.2.2菌种的分离与纯化2.2.2.1稀释倾注分离法无菌操作，用接种钩从长满毛霉菌丝的母种试管中挑取部分洁白的菌丝体于10mL 无菌水中，振摇，制成孢子悬浮液。
取盛有9mL无菌水的试管6支，分别标记1、2、3……用无菌吸管取1mL孢子悬浮液注入1号试管内，用吸管吸三次均匀，记为10-1。
然后从1号试管内取1mL于2号试管内，通过吸管的吹吸混合均匀，记为10-2。
同样从2号试管内取1mL于3号试管内，记为10-3。
以此类推，直至10-6。
用3支无菌试管分别吸取后三个稀释度的稀释液各1mL于三个无菌培养皿中，然后加入融化后冷却至45～50℃的固体培养基12～15mL，迅速摇匀，倒置于培养箱中培养2～3天[8]。
2.2.2.2斜面菌种培养无菌操作，将接种针插入原种试管内挑些菌种孢子，送入培养基试管中，轻轻在培养基表面划成S形曲线，迅速拔出接种针，两支试管口及棉塞放在火焰上消毒一次，塞好棉塞。
从接种箱中取出，培养实验规定的时间。
不断重复以上操作，直至分离培养出无杂菌，菌丝为白色，粗壮浓密而有力的毛霉。
2.3菌种的扩大培养及种曲最佳培养条件的确定2.3.1三角瓶扩大培养工艺流程：豆渣和麸皮→以不同比例混合均匀→调以适合水分含量→装瓶→灭菌→冷却→接种并打散培养基→保温培养→观察操作过程：培养基制备：豆渣跟麸皮以不同比例混合均匀（按各研究条件配料），调节至实验所需水分含量，将材料搅拌均匀。
装入三角瓶中，装量2-3cm，尽量疏松。
塞上棉塞，灭菌121℃，40min，灭菌后趁热摇散，冷却备用。
接种：用接种钩挑取斜面试管种1-2块，迅速接入制备好的培养基中，置于实验所需温度的恒温箱中培养，至实验所需的培养时间。
2.3.2单因素试验分析方法：通过三角瓶培养实验，以感官特性、镜检和平板杂菌检验观察毛霉的生长情况，分别研究培养基的营养配比、培菌过程中水分含量、培养温度和培养时间对种曲质量的影响。
质量检验：感官特性：优良成曲的外观成块状，内部菌丝洁白，整齐健壮，孢子丛生，无夹心，无根霉（灰黑绒毛）、青霉（蓝绿色斑点）等杂菌，无异色。
具有种曲固有的曲香，无霉味、酸味、氨味等不良气味。
用手指触及种曲，物料疏松，富有弹性。
镜检：显微镜下观察毛霉的菌丝形态及孢子生长情况。
平板杂菌检验：无菌操作，将培养出来的种曲接种到琼脂平板上，25℃培养48h，观察是否有杂菌生长。
若出现倒毛及无力软毛菌丝体，黑、绿色等的杂菌斑点或者只生长一层菌膜,则判定为杂菌污染。
2.3.2.1培养基营养配比对种曲质量的影响：调配培养基，其中豆渣的含量为0%、50%、75%、90%、100%，分别在25℃培养条件下观察种曲的培养状况。
48h 后制成孢子悬浮液接种到白坯上，观察毛霉的生长状况。
2.3.2.2水分对种曲培养的影响：将豆渣含量调配为90%，加入一定量的水使培养基含水量分别为55%、60%、65%、70%、75%、80%,在25℃下培养48h,比较不同含水量对种曲质量的影响。
2.3.2.3温度对种曲培养的影响：将豆渣含量调配为90%，水分含量为75%，分别在20℃、25℃、28℃、30℃下培养48h,观察并记录种曲的培养情况。
2.3.2.4时间对种曲生长的影响：将豆渣含量调配为90%，水分含量为75%，在25℃下分别培养24h 、36h 、40h 、48h 、56h 、60h 、72h ，观察并记录种曲的培养情况。
2.3.3曲种培养条件的优化（正交试验） 2.3.3.1分析方法：孢子数的测定仪器：显微镜，血球计数板，盖玻片，烧杯，毛细管，容量瓶。
操作方法：样品稀释：称取精确称取种曲2g (称淮至0.002g),倒入盛有玻璃珠的250mL 锥形瓶内，加95%酒精5mL ，加无菌水20mL ，加稀硫酸10m ，充分振摇,使分生孢子个个分散，然后用多层纱布过滤、冲洗，务使滤渣不含孢子，稀释至500mL 。
制片：取稀释液1滴，滴于血球计数板的计算格上，然后将盖片轻轻由一边向另一边压下，使盖片与计数板完全密合，液中无气泡，用滤纸吸干多余的溢出悬浮孢子液，静置数分钟，待孢子沉降。
观察计数：用低倍镜头或高倍镜头观察。
由于稀释液中的孢子，在血球计数板上 处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微细螺旋，才能不使遗漏。
孢子常位于大格的划线上，应一律取二边计数，而弃另二边，以减少误差。
使用16×25的计数板时，只计板上四个角上的4个大格(即100个小格)。
如果使用25×16的计数板，除计四个角的4个大格外，还需要计中央一大格的数目(即80个小格)。
每个样品重复观察计数不少于2次,然后取其平均值。
即为该样品种曲的孢子数。
计数：孢子数（个／克）= ━━×400×10000× ━━━式中:A ——80个小格内孢子总数，个；m ——样品重量，g 。
A 50080 m2.3.3.2正交实验设计以孢子数为指标，通过正交试验确定种曲培养的最优条件。
试验设计见表1。
表1 优化培养条件的正交试验因素水平试验号 因 素A 豆渣含量/%B 水分含量/%C 培养温度/℃D 培养时间/h 1 1（90） 1（65） 1（20） 1（40） 2 1 2（70） 2（25） 2（48） 3 1 3（75）3（28）3（56）4 2（75） 1 2 35 2 2 3 16 2 3 1 27 3（50） 1 3 28 3 2 1 3 933212.4优质孢子粉的制备研究 2.4.1干燥流程将洗净的托盘放于干燥箱中进行150℃高温灭菌1h →将培养好的毛霉连同培养基经灭菌的小铁铲打散→倒入托盘中摊薄并分散均匀→恒温干燥 2.4.2干燥温度的控制按照 2.4.1的干燥流程，设定干燥温度分别为25-30℃、30-40℃、40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃、60-70℃和70-90℃，以30%的烘干率对种曲进行干燥，制成孢子粉，以孢子死亡情况和杂菌污染情况为指标，确定干燥的最佳温度。
2.4.3干燥程度的控制将种曲的烘干率分别控制在20%、30%、40%、50%、60%，观察其制成粉末的难易程度、杂菌污染情况及活性恢复的难易程度。
烘干率以下面公式计算： 烘干率= ×100%3结果分析与讨论3.1培养基营养配比对种曲质量的影响麸皮含有适合微生物生长和利用的营养成分，经测定含有：蛋白质16．4％，灰分6．5％，淀粉9．0％ ，水分13％，脂肪3．58％，镁0．72％，磷2．7％，铁0．0l ％，钾1．46％，生物素210ug ／kg ，维生素B112000ug ，已经广泛应用于固体发酵的基质，作为氮源[9]。
豆渣含有相当数量的蛋白质和碳水化合物。
据资料介绍，含蛋白质(干基)34.4%，粗纤维28.15，粗脂肪13.6%，水份80% [10]是一种较理想的种曲原料。
为了获得更多的菌体和孢子，其纯麸皮培养基申的氮源含量可增加一些。
况且豆渣中的氮主要以蛋白质和蛋白质的各种降解产物的形式存在，特别是氨基酸可以直接被菌体吸收，更有利烘干后的种曲质量烘干前的种曲质量于细胞内的蛋白质合成[11]。
