高效液相色谱分析法周老师

①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈

图2 Fig． 2 盐酸阿考替胺三水合物粗品在不同甲醇比例下的 色谱图 HPLC chromatograms of acotiamide hydrochloride trihydrate products under different methanol ratio
2． 3
2
2． 1
结果与讨论
流动相种类的选择 分别用甲醇 － 水、 乙腈 － 水、 甲醇 － 乙酸铵水溶
缓冲溶液 pH 值的选择 保持乙酸铵浓度为 20 mmol / L 不变， 用冰乙酸 或氨水分别调节其 pH 值在 5． 5 ～ 7． 5 之间。 考察
液、 乙腈 － 乙酸铵水溶液作为流动相。 以甲醇 － 水 — 872 —
流动相的 pH 值对保留时间及峰形的影响。 结果表 pH 值的改变对保留时间影响不大， 明， 只会影响盐
收稿日期： 2014 － 07 － 01 ； 修回日期： 2014 － 10 － 05 ； 接受日期： 2014 － 11 － 15 基金项目： 国家重点基础研究发展计划 （ 973 计划） 项目（ 2011CB911003 ） ； 国家自然科学基金项目 （ 21275069 ） ； 南京大学分析测试基金 mail： zwq66440@ 126． com。 作者简介： 周圩群， 实验师， 主要从事色谱分离和分析 。Email： hzlian@ nju． edu． cn。 通讯作者： 练鸿振， 教授， 博士生导师， 主要从事色谱分离和分析 。E-
1． 2
色谱条件 色谱柱： Ultimate XB － C18 柱 （ 4． 6 mm × 150 5 μm） 购自月旭材料科技 （ 上海 ） 有限公司； 柱 mm，
温 30℃ ； 流动相： 甲醇 － 20 mmol / L 乙酸铵水溶液 = 45 ∶ 55 （ V / V） ； 流速 1． 0 mL / min； 进样量 10 μL； 检测波长 280 nm。 1． 3 对照溶液及样品溶液的配制 精确称取盐酸阿考替胺三水合物对照品 25 mg 于 25 mL 容量瓶中， 以流动相溶解， 并定容， 配制成 1 mg / mL 的储备溶液， 分别用流动相稀释成 0． 5 、 0． 4 、 0． 2 、 0． 1 、 0． 05 、 0． 02 、 0． 01 、 0． 005 、 0． 002 、 0． 001 、 0． 0006 、 0． 0005 和 0． 0001 mg / mL 的系列标 准溶液， 待用。 精确称取盐酸阿考替胺三水合物粗品 10 mg 于 25 mL 容量瓶中， 以流动相溶解并定容。

高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、 添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气 中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、 可在室温下进行分离、可分析复杂样 品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成 分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等， 保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中 的有机污染物，如酚类、苯胺类 等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物 的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确 保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进 行适当的预处理，如离心、 过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组 分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡 原理。

图 3 2,4-D 酸线性关系图
图 4 2,4-二氯酚线性关系图
表 1 精密度测定结果
样品 名称 1
实验序号
2
3
4
平均 5 值/%
2,4 滴 酸/%
0.13
0.13
0.12
0.13
0.13
0.13Байду номын сангаас
2,4-二 氯酚/ 0.86 0.84 0.85 0.84 0.85 0.85
%
3.5 分析方法的准确度试验
目 前 2,4-滴 丁 酯 原 药 中 2,4-二 氯 酚 和 2,4-滴 酸的测定在 GB 22600-2008 中有详细的介绍，但笔 者 以 为 国 家 标 准 中 2,4-滴 丁 酯 原 药 的 两 种 杂 质 采 用两种方法去测定，比较繁琐。 国内未见文献报道 同时检测两组分。 本文通过参考文献，试验确定以 COSMOSIL5 C18-MS-Ⅱ柱高效液相色谱法同 时 测 定 2,4-二氯酚和 2,4 滴酸含量。 此方法操作简便，快 速，重现性好。 定量准确易于工业化生产检测。 2 实验部分 2.1 仪器
4.9min。
A：2,4-滴酸 B：2,4-二氯酚 图 1 2,4-滴酸和 2,4-二氯酚标样色谱图
A:2,4-滴酸 B:2,4-二氯酚 C:2,4-滴丁酯 图 2 2,4-滴酸和 2,4-二氯酚样品色谱图 上述液相色谱条件系典型操作参数， 可根据不 同仪器特点对给定操作参数做适当调整， 以期获得 最佳效果。 2.4 测定步骤 2.4.1 标样溶液的配制 准确称取 0.02g（精确至 0.0002g）2,4-滴酸标样 和 0.02g（精 确 至 0.0002g）2,4-二 氯 酚 标 样 ，置 于 同 一 50mL 容量瓶中，加约 20mL 甲醇，放在超声波中 处理 10min， 取出冷至室 温 用 甲 醇 稀 释 至 刻 度 ，摇 匀；用移液管准确移取 5mL 置于 50mL 容量瓶中，用 甲醇稀释至刻度，摇匀；备用。 2.4.2 试样溶液的配制 准确称取约含 0.02g2,4-二氯酚 （精确至 0.0002g） 试样，置于 50mL 容量瓶中，向容量瓶中加约 20mL 甲