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凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究摘要：凝结芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，在农业、医药、食品等领域具有重要的应用前景。
本研究旨在筛选出高效的凝结芽孢杆菌菌株，并研究其高密度培养工艺。
通过多次传代培养和菌落数量筛选，最终得到了一株菌株生长快速、产孢量高的凝结芽孢杆菌菌株。
进一步实验优化了培养基组成、培养条件等参数，最终实现了高密度培养，为凝结芽孢杆菌的大规模生产提供了理论和技术依据。
关键词：凝结芽孢杆菌、筛选、培养基、培养条件、高密度培养1. 引言凝结芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤中。
凝结芽孢杆菌具有较高的生物学活性，可以产生多种酶类、抗生素和生物活性化合物，对农业、医药、食品等行业具有广泛应用前景。
因此，筛选高效的凝结芽孢杆菌菌株，并建立适宜的培养工艺，对于其应用的推广和产业化具有重要意义。
2. 筛选菌株本研究从土壤样品中分离得到多株凝结芽孢杆菌菌株，并通过多次传代培养筛选得到一个优良的菌株。
首先，将土壤样品加入到适宜的培养基中，经过48小时培养后，菌落形态和颜色等特征有所不同。
然后，挑选出生长快速且菌落外观较好的菌株进行进一步培养。
通过多次传代培养，筛选出菌株的菌落数量逐渐增加，生长特性更加稳定。
3. 培养基组成优化为了进一步提高凝结芽孢杆菌的生长速度和菌落质量，进行了培养基组成的优化。
通过单因素实验和正交试验，确定了最佳培养基组成：葡萄糖25g/L、酵母膏10g/L、乳酸钠3g/L、花生酸2g/L、无机盐溶液10mL/L和蒽酮素0.2g/L。
在优化培养基的基础上，凝结芽孢杆菌菌株的生长速度得到了进一步提高。
4. 培养条件调控温度、pH值、接种量等因素对于凝结芽孢杆菌的生长和孢子产量具有重要影响。
在研究中，通过改变培养温度、调节培养液pH值和优化接种量等因素，获得了较高的孢子产量。
最佳的培养条件为：培养温度37℃，培养液pH值7.0，初始接种量为0.1%。
凝结芽孢杆菌增殖条件及抗性的研究姚勇芳;廖延智;陈玉锋;谭才邓;邝哲师【摘要】The study was conducted to investigate the proliferation and resisitance of Baclillus coagalans. The results showed that:the optimum medium formula included sodium chloride 2 g/L,peptone 5 g/L,yeast powder 25 g/L,maltose 6 g/L,magnesium sulfate 1.2 g/L,manganese sulfate 0.3 g/L,sodium phosphate dibasic:sodium dihydrogen phosphate 3.0 g/L:5 g/L;the optimum culture conditions were as folbous: the initial pH value of 7.4,180 r/min,at 37℃ for 20 h speed training,th e total number of colonies can reach 3.8×1011CFU/mL. B. coagulans resistance values:D80℃= 82.24 min,R280℃= 0.9943,D90℃= 47.92 min,R290℃= 0.9955,D100℃=16.92min,R2100℃= 0.9944. The thermal death curve equation was y = -3.266x + 342.96. In the environment of pH value of 2~6 and 0.2%~1.4% pig bile salt solution,the survival rate of B. coagulans was 100%. The aim of this experiment is to provide basis for the application of this strain in feed fermentation industry.%试验以凝结芽孢杆菌活菌数为指标,对凝结芽孢杆菌的增殖条件及抗性能力进行研究.结果表明,培养基最适配方为:氯化钠2 g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉25 g/L,麦芽糖6 g/L,磷酸氢二纳:磷酸二氢钠= 5 g/L:8 g/L,硫酸镁1.2 g/L,硫酸锰0.3 g/L;最适培养条件为:初始pH值7.4、转速180 r/min、37℃培养20 h,菌落总数可达到3.8×1011CFU/mL.凝结芽孢杆菌耐热性值:D80℃= 82.24 min,R280℃= 0.9943, D90℃= 47.92 min,R290℃= 0.9955,D100℃= 16.92 min,R2100℃= 0.9944,凝结芽孢杆菌的热力致死曲线方程为y= -3.266x +342.96.在pH值为2~6及0.2%~1.4%猪胆盐溶液环境中存活率超过100%.试验旨在为该菌种能广泛应用饲料发酵行业提供依据.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2017(044)011【总页数】8页(P138-145)【关键词】凝结芽孢杆菌;增殖条件;热力致死曲线;耐酸;耐胆盐【作者】姚勇芳;廖延智;陈玉锋;谭才邓;邝哲师【作者单位】广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院,广东广州 510300;广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院,广东广州 510300;广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院,广东广州 510300;广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院,广东广州 510300;广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,广东广州510610【正文语种】中文【中图分类】S182凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）又称为芽孢乳酸菌，属于硬（或厚）壁菌门肠道乳酸菌，是一类革兰氏阳性、兼性厌氧、可产芽孢的特殊乳酸菌。
［9］贾刚，王康宁，曾静康.谷氨酰胺小肽的吸收及其营养生理效应研究进展［J］.四川畜牧兽医，2004，31（8）：32-33.［10］蒋建文，黎介寿.甘氨酰谷氨酰胺二肽改善猪自体移植小肠的吸收功能［J］.肠外与肠内营养，2001，7（2）：80-82.［11］刘伟敏，刘忠臣，李新艳，等.谷氨酰胺肽在断乳仔猪饲料中的应用［J］.饲料博览，2003（6）：29-30.［12］席鹏彬，林映才，蒋宗勇，等.谷氨酰胺二肽对断乳仔猪生长、免疫、抗氧化力和小肠黏膜形态的影响［J］.动物营养学报，2007，19（2）：135-141.［13］曾翠平.甘氨酰谷氨酰胺对早期断乳仔猪的促生长作用及其机制［D］.广州：华南农业大学博士学位论文，2004.［14］杨彩梅，徐卫丹，陈国安.甘氨酰-L-谷氨酰胺对断乳仔猪生长性能及肠道吸收功能的影响［J］.中国畜牧杂志，2005，41（8）：6-9.［15］张锐昌.酶解小麦蛋白制备多肽及功能性质的研究［D］.杨凌：西北农林科技大学硕士学位论文，2006.［16］Tanabe S，Arai S，Watamabe rge scale production of a high glutamine peptide［J］.J Japn Soc Nutr FoodSci，1999，52：103-106.［17］刘文豪，徐志宏，孙志达，等.二次酶解麦谷蛋白制备富含谷氨酰胺（Gln）活性肽营养液的研究［J］.中国粮油学报，2009，24（4）：32-36.［18］Tanabe S，Watamabe M，Arai S.Production of a high-Gln oligopeptide fraction from gluten by enzymatic treat-ment and evaluation of its nutritional effect on the smal1intestine of rats［J］.J of Food Biochem，1993，16：235-248.［19］杨小军.灌喂大豆、面筋蛋白的胃蛋白酶酶解物对大鼠免疫功能的影响［D］.南京：南京农业大学硕士学位论文，2003.［20］周业飞.面筋蛋白酶解物调节肉鸡免疫器官及ND抗体水平的研究［J］.动物医学进展，2006，27（3）：65-68.［21］王石，王卫国.谷朊粉酶解物对断乳仔猪生产性能、腹泻及消化率的影响［J］.粮食与饲料工业，2011（2）：55-57.［22］刘珍，王卫国.谷朊粉的风味蛋白酶水解工艺［J］.饲料研究，2007（8）：4-7.［23］张海华，周惠明.小麦面筋蛋白结构及其改性研究［J］.粮食与油脂，2010（9）：1-3.1凝结芽孢杆菌概况凝结芽孢杆菌在中华人民共和国农业部第1126号公告《饲料添加剂品种目录》（2008）中已被列入保护期内的新饲料和新饲料添加剂，其批准使用时间为2004年5月，适用范围为肉用仔鸡和生长育肥猪，说明其安全性、有效性、经济性和对环境的影响已通过了全国饲料评审委员会评审，并得到农业部批准由天津新星兽药厂生产。
凝结芽孢杆菌的特性及研究进展赵树平;包维臣;高鹏飞;姚国强;郭霄;张和平【摘要】论文主要对凝结芽孢杆菌的一般特性、益生作用机理及其在动物和人体方面的研究进展进行了阐述,旨在为凝结芽杆菌的进一步研究提供一定的理论基础.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2014(035)002【总页数】6页(P6-10,20)【关键词】凝结芽孢杆菌;特性;作用机理;研究进展【作者】赵树平;包维臣;高鹏飞;姚国强;郭霄;张和平【作者单位】内蒙古和美科盛生物技术有限公司,内蒙古呼和浩特010010;内蒙古和美科盛生物技术有限公司,内蒙古呼和浩特010010;内蒙古和美科盛生物技术有限公司,内蒙古呼和浩特010010;内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古和美科盛生物技术有限公司,内蒙古呼和浩特010010;内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】S811.619世纪初，凝结芽孢杆菌因导致炼乳出现大规模的凝结现象及番茄、土豆等制品的酸败变质被深入的研究，而于1932年被首次分离并对其进行了详细描述[1-3]。
发展至今，诸多研究表明凝结芽孢杆菌作为一种独特的新型芽孢益生菌，其既具有乳酸菌的产乳酸特性，又具有芽孢杆菌的丰富的酶系统及抗逆性强、耐高温高压、稳定的储存特性。
作为益生菌家族的后起之秀，被广泛地应用于医药、食品、保健、畜牧和水产等行业，并能产生多种健康的影响：调整肠道微生态平衡、提高机体免疫、产生抑菌物质及促进动物生长，成为益生菌中研究的热点。
本文对国内外关于凝结芽孢杆菌特性、益生作用、益生机理及在动物中的应用总结和概括。
1.1 凝结芽孢杆菌的一般特性随着对凝结芽孢杆菌研究的不断深入，其特性也逐渐被人熟知。
凝结芽孢杆菌的研究进展01-21益生菌凝结芽孢杆菌是近年来国内外学者的研究热点。
凝结芽孢杆菌具有与乳酸杆菌、双歧杆菌一样的调节肠道内菌群平衡、促进营养物质代谢和利用、提高免疫力等保健特性，凝结芽孢杆菌形成的芽孢具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性特点。
凝结芽孢杆菌作为新型微生态制剂，在畜牧业、水产养殖业、医药、保健和食品行业被广泛应用。
作者在此简单概述凝结芽孢杆菌的理化性质以及在工业生产、养殖业以及临床等方面的应用进展。
1凝结芽孢杆菌的理化性质凝结芽孢杆菌为芽孢杆菌属革兰氏阳性杆菌，端生芽孢，表面无鞭毛，多数菌两端钝圆，少数菌为短链状。
凝结芽孢杆菌的最适生长pH值为6.6～7.0，最适生长温度为45～50 ℃，可以分解糖类生成L－乳酸，为同型乳酸发酵菌。
凝结芽孢杆菌具有产L-乳酸、生成芽孢、兼性厌氧、耐酸等生理生化特征，经口服进入到肠胃后，具有益生保健特性。
产L-乳酸特征，使得肠道中的双歧杆菌等利用乳酸的有益菌能更好地生长与繁殖。
生成芽孢特征，可以更好地恢复胃肠道的微生态平衡，且所产芽孢使得凝结芽孢杆菌能够耐受胃液的低pH值环境。
兼性厌氧特征，使得凝结芽孢杆菌适宜在人体消化系统尤其是肠道等低氧环境下生长。
耐酸特征，则保证了凝结芽孢杆菌有85％的概率通过胃液在肠道存活生长。
但是由于凝结芽孢杆菌没有鞭毛，导致其粘附性较弱，无法在肠道中长期存活。
凝结芽孢杆菌在肠道中还会分泌大量有益物质，如淀粉酶、蛋白酶、B族维生素、氨基酸、短链脂肪酸和凝固素等，这些物质不仅有利于肠道消化吸收还能抑制有害细菌。
特别是凝固素，在60℃、pH值4～8的条件下处理90min 仍保持生物活性，且不受淀粉酶、酯酶和有机溶剂的影响。
因此，凝结芽孢杆菌对胃肠道炎症有一定的治疗作用。
凝结芽孢杆菌还具有很强的抗逆性，在高温、高渗和酸性环境下均保持较高的存活率，能有效穿过胃液环境（强酸和消化酶），在肠道生长，并发挥益生作用。
但在酸性环境中，凝结芽孢杆菌对热耐受性下降。
2010No．5Serial No．218China BrewingFPA 分别达到7105.92U/g 和1463.97U/g 。
参考文献：[1]李亚澜，张建强.纤维素高效降解菌的分离鉴定及固态发酵条件的研究[D].西南交通大学硕士论文，2005.[2]姜绪林，张星元.绿色木霉固态发酵产纤维素酶的研究[D].江南大学硕士论文，2005.[3]马旭光，张宗舟，刘星斌.航天诱变黑曲霉菌株ZM-8产纤维素酶的固态发酵条件研究[J].中国酿造，2008（23）：37-40.[4]邬敏辰，李江华.里氏木霉固体发酵生产纤维素的研究[J].江苏食品与发酵，1998（2）：2-6.[5]GHOSE T K.Measurement of cellulose activities[J].Pure and ApplyChem,1987,58(2):257-268.[6]范艳丽，邵林广.纤维素降解菌的筛选及特性研究[D].武汉科技大学硕士论文，2004.[7]王艳昆，张建强.纤维素高效降解混合菌的筛选及其糖化发酵条件研究[D].西南交通大学硕士论文，2007.乳酸菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称[1]。
普通乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等）不易存活，不能耐受强酸、强碱和高温，不是理想的微生物制剂。
于是，寻找一种抗逆性强的乳酸菌便成了研究的重点。
其中最突出的是凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans ），1989年美国FDA 公布的41种可用于饲料的安全菌株及1992年再次批准42种中包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位，其是一种可以产生乳酸的芽孢杆菌，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的优点，且抗逆性强，能调节动物肠道微生态平衡，促进动物消化和提高动物免疫力等，现已应用于饲料工业中[2-3]。
由于最终制成的菌剂要有芽孢的形式才具有高抗性，芽孢没有新陈代谢，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等，是较为理想的微生物制剂[4]。
试验主要通过摇瓶液体发酵，优化培养基及培养条件来提高凝结芽孢杆菌菌液中芽孢数，为后期的加工制成高效的凝结芽孢杆菌制剂打下良好的基础。
1材料与检验方法1.1试验材料菌种：凝结芽孢杆菌F5（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保存）。
培养基：YPD 培养基：葡萄糖20g ，胰蛋白胨20g ，酵母粉10g ，水1000mL ；调pH 值为7.0，115℃灭菌20min 。
为菌种活化时用。
1.2方法1.2.1菌种活化将保存的凝结芽孢杆菌转接到YPD 试管斜面培养基中，40℃培养24h ，备用。
1.2.2活菌计数法活菌总数测定采用稀释平板计数法[5]，芽孢计数法是把菌液80℃水浴10min 后稀释平板计数。
1.2.3种子液的制备取1环活化的菌种，接入装有50mL YPD 液体培养基一株凝结芽孢杆菌产芽孢条件的研究杨立华，赵述淼，冷一非，梁运祥*（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070）摘要：通过培养基组成正交试验及培养条件单因素试验，对一株凝结芽孢杆菌的产芽孢条件进行了优化，优化后的培养基组成（质量分数）为酵母粉3g/L ，蛋白胨5g/L ，牛肉膏2g/L ，MnSO 40.005g/L ，NaCl 2g/L ，K 2HPO 43g/L ，MgSO 40.02g/L 。
最优的培养条件为温度40℃，初始pH 值为7.0，转速210r/min ，装液量为250mL 的三角瓶装30mL ，接种量为6%（v/v ），发酵时间为48h 。
最终的芽孢数为9.1×108cfu/mL 。
关键词：凝结芽孢杆菌；芽孢形成；培养条件；优化中图分类号：Q93-335文献标识码：A文章编号：0254-5071（2010）05-0096-03Spore-forming conditions of Bacillus coagulansYANG Lihua,ZHAO Shumiao,LENG Yifei,LIANG Yunxiang*(State Key Laboratory of Agromicrobiology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)Abstract:The optimal conditions of spore-forming by Bacillus coagulan were investigated using the single factor and orthogonal tests in this paper.The optimal medium were as follows :yeast extract 3g/L,peptone 5g/L,beef extract 2g/L,MnSO 40.005g/L,NaCl 2g/L,K 2HPO 43g/L and MgSO 40.02g/L.The optimal culture conditions were obtained by single-factor test as follows:temperature 40℃,initial pH 7.0,rotation speed 210r/mim,volume of shaking flask 30ml/250ml,and fementation time 48h.Under these conditions,the number of spore reached 9.1×108cfu/ml.Key words ：Bacillus coagulans ;sporulation;culture conditions;optimization收稿日期：2009-12-26作者简介：杨立华（1985-）,女，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向为发酵工程；梁运祥*，教授，通讯作者。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Research Report96··中国酿造2010年第5期总第218期的250mL 三角瓶中，40℃、180r/min 培养18h 。
1.2.4芽孢率的判定[6]芽孢率是活菌计数法得到的芽孢数和总菌数的百分比。
1.2.5正交试验在培养基单因素试验的基础上做7因素（酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、MnSO 4、NaCl 、K 2HPO 4、MgSO 4）2水平正交试验[7-8]。
1.2.6培养条件的优化采用最优培养基配方，固定摇瓶培养的条件后，对最佳发酵时间、温度、初始pH 值、接种量、装液量进行逐一优化。
2结果与分析2.1正交试验（见附表）由附表可以看出，各因素主次为MnSO 4＞酵母粉＞NaCl ＞试验号AMnSO 4/（g ·L -1）BNaCl/（g ·L -1）C 酵母粉/（g ·L -1）D 蛋白胨/（g ·L -1）E 牛肉膏/（g ·L -1）FK 2HPO 4/（g ·L -1）GMgSO 4/（g ·L -1）总菌数/（×108cfu ·mL -1）芽孢数/（×108cfu ·mL -1）芽孢率/%11（0.005）1（2）1（5）1（2）1（1）1（0.02）1 5.0 4.69221112（10）2（3）2（2）212.0 3.220312（6）2（10）112212.5 2.7204122221117.40052（0.5）1212128.3006212212117.2 1.53107221122112.2 1.531582212112 6.40.35K 1 2.625 2.333 2.408 2.208 2.283 1.225 1.915K 20.840 1.13 1.058 1.258 1.183 2.240 1.550R1.7851.201.3500.9501.1001.0150.365附表发酵培养基正交试验结果与分析Attached table.Results of orthogonal test for fermentation medium牛肉膏＞KH 2PO 4＞蛋白胨＞MgSO 4；最优组合为A 1B 1C 1D 1E 1F 2G 1，即酵母粉3g/L ，蛋白胨5g/L ，牛肉膏2g/L ，MnSO 40.005g/L ，NaCl 2g/L ，K 2HPO 43g/L ，MgSO 40.02g/L 。
2.2培养条件的研究把上述正交试验最优组合的作为研究培养条件的基础培养基，在此基础上研究不同培养条件对芽孢数的影响。
起初的培养条件为初始pH7.0，250mL 三角瓶装液量50mL ，培养温度40℃，180r/min 摇床培养48h ，接种量2%（v/v ）。
2.2.1不同初始pH 值对芽孢生长的影响分别设定发酵培养基的初始pH 值为6.5、6.8、7.0、7.2、7.5。
250mL 三角瓶装液量50mL ，不同pH 值条件下总菌数、芽孢数的变化见附图A 。
由附图A 结果表明，总菌数、芽孢数随发酵培养基的初始pH 值增大，先增大后减小，在pH 值为7.0时总菌数、芽孢数均最大。
因此，选择发酵培养基的初始pH 值为7.0。
2.2.2不同培养温度对芽孢杆菌生长的影响分别使培养温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，经跟踪检测发现，30℃、35℃培养48h 后镜检发现无芽孢，全是营养体。
再将其一直培养至60h 、72h ，分别镜检，发现均无芽孢。
50℃培养48h 后镜检芽孢率近5%，且发现有自溶的现象。
对结果综合分析发现，45℃总菌数较高，为6.3×108cfu/mL ，40℃时总菌数为6×108cfu/mL ，但是芽孢率（65%）和芽孢数（5.0×108cfu/mL ），均不如40℃时的芽孢率（98%）和芽孢数（5.9×108cfu/mL ），故选择40℃为最佳培养温度。
2.2.3不同转速对芽孢杆菌生长的影响在温度40℃、装液量50mL 、pH 7.0，分别使转速为120r/min 、150r/min 、180r/min 、210r/min 、240r/min 。
培养48h 后分别取菌液镜检，并活菌计数。
其结果检附图B 。
由附图B 结果表明，当转速为210r/min 时，芽孢数最大，为6.5×108cfu/mL ，分别为转速为240r/min 时，总菌数为10.8×108cfu/mL ，但没产芽孢。
综合考虑，选择210r/min 为最佳摇床转速。
