最全的液相色谱知识 整理
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最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）
最全的液相色谱知识（包括原理,维护,基础操作,处理方法）最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）L、基线漂移原因和解决方法1、柱温波动。
（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
）解决方法：控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图2、流动相不均匀。
（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
）解决方法：使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。
流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
如有需要，可以用1N的硝酸。
（不要用盐酸）4、检测器出口阻塞。
（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）解决方法：取出阻塞物或换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化解决方法：更改配比或流速。
为避免问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时解决方法：用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成解决方法：检查流动相的组成。
使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
解决方法：重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
解决方法：将波长调整至最大吸收波长处M、基线噪音（规则的）原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气解决方法：流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液解决方法：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要，更换泵密封。
液相色谱基础知识
电导检测器
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
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柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
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手动进样阀7725i原理
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☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
经典液相色谱知识点总结
经典液相色谱知识点总结液相色谱（Liquid Chromatography, LC）是一种以液相为驱动相，将待测样品在静态相中进行分离的色谱分析方法。
液相色谱在分离生化样品、药物、天然产物等化合物时得到了广泛的应用。
本文将系统总结液相色谱的知识点，包括原理、分类、仪器设备、色谱柱、检测方法等方面的内容。
一、原理液相色谱的原理基于化合物在静态相（色谱柱填料）和流动相（溶剂）之间的分配与分离过程。
待分析的化合物在流动相与静态相之间的分配系数不同，因此当待测样品溶液通过色谱柱时，根据不同化合物在静态相中的分配行为，可以实现化合物的分离。
在液相色谱中，流动相主要由溶剂和缓冲液组成，可以根据需要进行调整。
而静态相则是色谱柱填料，填料的选择对色谱分离效果至关重要。
填料的种类、粒径、表面性质等都会影响到分离效果。
二、分类根据静态相的不同，液相色谱可以分为几种常见的类型：1、反相色谱：静态相是疏水性填料，流动相是亲水性溶剂，被分离物质的极性与填料相反。
反相色谱对极性化合物具有较好的分离效果，因此在分析生化样品、药物等方面得到了广泛的应用。
2、离子交换色谱：静态相是带电离子交换树脂填料，可进行阴离子或阳离子的分离。
离子交换色谱适用于分析离子化合物，如蛋白质、核酸等。
3、尺寸排除色谱：静态相是孔径大小均一的凝胶填料，根据分子大小进行排除分离。
尺寸排除色谱适用于分析大分子化合物，如蛋白质、多糖等。
4、亲和色谱：通过生物亲和分离剂与化合物间的特异性结合实现分离，主要应用于生化分析领域。
5、扩展液相色谱：液相色谱的一种改良方法，通过使用超高性能色谱柱和压力增加装置来提高分辨率。
三、仪器设备液相色谱仪器主要包括流动相输送系统、样品进样装置、色谱柱和检测器等部分。
1、流动相输送系统：用于输送流动相的高性能泵，包括梯度泵和等速泵两种，可实现不同流动相梯度的传送。
2、样品进样装置：通常采用自动进样系统，可实现自动进样、样品预处理等功能。
高效液相色谱知识收藏
高效液相色谱知识收藏1. 分离原理：HPLC利用固定在填料中的固定相和流动相（溶剂）之间的相互作用来分离混合物中的化合物。
固定相通常是多孔填料，而流动相则是溶解样品混合物的溶剂。
在流动相的作用下，样品中的化合物会以不同速率通过固定相，从而实现分离。
2. 设备组成：HPLC主要由溶剂输送系统、样品进样器、固定相柱和检测器组成。
溶剂输送系统用于向柱中输送流动相，样品进样器用于将样品注入HPLC系统，固定相柱用于实现化合物的分离，检测器用于检测分离出的化合物。
3. 应用领域：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全、生命科学研究等领域。
它可以用于分离和测定各种化合物，包括药物、天然产物、食品添加剂等。
4. 操作要点：在进行HPLC分析时，需要注意溶剂的选择、固定相柱的条件、检测器的调试等细节。
同时，样品的预处理和进样器的设定也会影响分析结果的准确性和稳定性。
5. 数据分析：HPLC分析通常会生成大量的数据，包括色谱图谱、保留时间、峰面积等。
对这些数据进行分析和解释是HPLC分析的关键步骤，可以借助数据处理软件进行数据分析和处理。
总的来说，HPLC是一种高效、准确的分析技术，可广泛应用于化学、生物和医药领域。
了解HPLC的基本原理和操作要点，可以有效提高样品分析的准确性和效率。
HPLC是一种高效、准确的分析技术，可广泛应用于化学、生物和医药领域。
了解HPLC的基本原理和操作要点，可以有效提高样品分析的准确性和效率。
在HPLC分析中，固定相柱是至关重要的部分，不同的固定相柱适用于不同的样品类型和分离要求。
以下是一些常见的固定相类型：1. 反相色谱柱：反相色谱利用极性差异来进行化合物的分离，通常用于水溶性化合物的分离。
反相色谱柱的填料通常是非极性的，比如碳链分子。
常见的反相色谱柱填料包括C18、C8、C4等，它们的碳链长度不同，可以实现对不同极性化合物的分离。
2. 正相色谱柱：正相色谱是基于化合物在极性填料上的分离，适用于非极性化合物的分离。
液相色谱法知识点详解
柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃 柱中或是将固定相附着在毛细管 内壁上做成色谱柱，试样从柱头 到柱尾沿一个方向移动而进行分 离的色谱法。
2.纸色谱法（paper chromatography）
纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体， 把试样点在滤纸上， 然后用溶剂展开，各 组分在滤纸的不同位 置以斑点形式显现， 根据滤纸上斑点位置 及大小进行定性和定 量分析。
1.吸附色谱法 ( adsorption chromatography )
利用吸附剂表面对不同组分物理吸附 性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附 色谱法。
2.分配色谱法 ( partition chromatography )
利用固定液对不同组分分配性能的差别 而使之分离的色谱法称为分配色谱法。
§2 气相色谱的基本理论
容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质
，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相
及固定相的体积有关。 分配系数比(α):
k K Vs Vm
K2 k2 t'R2
K1 k1 t'R1
t’R2≠t’R1是混合物分离的首要条件
小结：
（1）色谱条件一定时，K或k值越大 ，则组分的保留值也越大。
（2） 两个组分的K或 k值相等，
基线宽度Wb=4
色谱流出曲线的意义
由色谱流出曲线可以实现以下目的：
（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中 所含组分的最少个数。
（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。 （3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分
析。
（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色 谱柱的分离效能。
7、分配系数和容量因子
1. 分配系数（distribution coefficient）
2.纸色谱法（paper chromatography）
纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体， 把试样点在滤纸上， 然后用溶剂展开，各 组分在滤纸的不同位 置以斑点形式显现， 根据滤纸上斑点位置 及大小进行定性和定 量分析。
1.吸附色谱法 ( adsorption chromatography )
利用吸附剂表面对不同组分物理吸附 性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附 色谱法。
2.分配色谱法 ( partition chromatography )
利用固定液对不同组分分配性能的差别 而使之分离的色谱法称为分配色谱法。
§2 气相色谱的基本理论
容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质
，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相
及固定相的体积有关。 分配系数比(α):
k K Vs Vm
K2 k2 t'R2
K1 k1 t'R1
t’R2≠t’R1是混合物分离的首要条件
小结：
（1）色谱条件一定时，K或k值越大 ，则组分的保留值也越大。
（2） 两个组分的K或 k值相等，
基线宽度Wb=4
色谱流出曲线的意义
由色谱流出曲线可以实现以下目的：
（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中 所含组分的最少个数。
（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。 （3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分
析。
（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色 谱柱的分离效能。
7、分配系数和容量因子
1. 分配系数（distribution coefficient）
液相色谱知识总结
佳留有半米旳距离以便人员检验仪器背面 板。
• :电源电压为220±10V，频率为
50±0.5Hz·最佳配置稳压器(2kw以上)
• 最佳 试验室有专线，同一线路上不可有大
旳用电机械干扰
• 电源为三相电源，接地必须良好(此条非常
主要)，泵，检测器，工作站，电
• 脑接在同一种合格旳接线板上 (温分每台
仪器带一专用接线板)
示差折光检测器
• 示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率
来进行组分检测旳。但凡具有与流动相折射率不 同旳组分，均能够使用这种 检测器。假如流动相 选择合适，能够检测全部旳样品组分。示差折光 检测器旳优点是通用性强，操作简便；缺陷是敏 捷度低，最小检出限约为10-7g/ml，不能做痕量 分析。另外，因为洗脱液构成旳变化会使折射率 变化很大，所以，这种检测器也不合用于梯度洗 脱。
常见问题及处理
• 1 压力 • 2 基线不稳 • 3 谱图重现性不好 • 4 凝胶负峰旳产生
液相色谱知识总结
液相色谱旳工作原理
• 高效液相色谱（high performance liquid
chromatography ）是色谱法旳一种分 支， 分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中旳各组分经过固定相时，因为与 固定相(stationary phase)发生作用（吸附、 分配、离子吸引、排阻、亲和）旳大小、 强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从 而先后从固定相中流出。
荧光检测器
• 在其他条件一定旳情况下，荧光强度与物质旳浓度成正比。
许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物能 够利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使其转 化为具有荧光活性旳衍生物。在紫外光激发下，荧光活性 物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。荧光检测器 是一种选择性检测器，它适合于稠环芳烃、氨基酸、胺类、 维生素、蛋白质等荧光物质旳测定。这种检测器敏捷度非 常高，检出限达10-12—10-13g/ml，比紫外检测器高2—3 个数量级，适合于痕量分析。而且能够用于梯度洗脱。其 缺陷是合用范围有一定旳不足。
• :电源电压为220±10V，频率为
50±0.5Hz·最佳配置稳压器(2kw以上)
• 最佳 试验室有专线，同一线路上不可有大
旳用电机械干扰
• 电源为三相电源，接地必须良好(此条非常
主要)，泵，检测器，工作站，电
• 脑接在同一种合格旳接线板上 (温分每台
仪器带一专用接线板)
示差折光检测器
• 示差折光检测器是根据不同物质具有不同折射率
来进行组分检测旳。但凡具有与流动相折射率不 同旳组分，均能够使用这种 检测器。假如流动相 选择合适，能够检测全部旳样品组分。示差折光 检测器旳优点是通用性强，操作简便；缺陷是敏 捷度低，最小检出限约为10-7g/ml，不能做痕量 分析。另外，因为洗脱液构成旳变化会使折射率 变化很大，所以，这种检测器也不合用于梯度洗 脱。
常见问题及处理
• 1 压力 • 2 基线不稳 • 3 谱图重现性不好 • 4 凝胶负峰旳产生
液相色谱知识总结
液相色谱旳工作原理
• 高效液相色谱（high performance liquid
chromatography ）是色谱法旳一种分 支， 分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中旳各组分经过固定相时，因为与 固定相(stationary phase)发生作用（吸附、 分配、离子吸引、排阻、亲和）旳大小、 强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从 而先后从固定相中流出。
荧光检测器
• 在其他条件一定旳情况下，荧光强度与物质旳浓度成正比。
许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物能 够利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使其转 化为具有荧光活性旳衍生物。在紫外光激发下，荧光活性 物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。荧光检测器 是一种选择性检测器，它适合于稠环芳烃、氨基酸、胺类、 维生素、蛋白质等荧光物质旳测定。这种检测器敏捷度非 常高，检出限达10-12—10-13g/ml，比紫外检测器高2—3 个数量级，适合于痕量分析。而且能够用于梯度洗脱。其 缺陷是合用范围有一定旳不足。
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
液相色谱知识汇总
1.色谱技术概述2.仪器的维护保养3.★仪器故障排除4.★软件操作5.软件安装6.★色谱方法的开发与改进7.★色谱峰的异常解析8.色谱法的技术参数9.色谱柱相关知识1)色谱柱的采购2)色谱柱的活化3)色谱柱的使用4)色谱柱的再生基本概念和理论一、基本概念和术语1．色谱图和峰参数⌝色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线。
又称色谱流出曲线(elution profile)。
⌝基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
⌝噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
⌝漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⌝谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。
⌝色谱峰(peak)——组分流经检测器时由响应的连续信号所产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
⌝拖尾因子(tailing factor，T) ，拖尾因子(tailing factor，T) ，W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d为峰极大至峰前沿之间的距离。
用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
（注意有些软件的计算方法表示不同）《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
⌝峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。
高效液相色谱法知识汇总(全面详细)
高效液相色谱法知识汇总（全面详细）1.与气相色谱相比液相色谱的优点与气相色谱法相比，液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性及相对分子质量的限制，只要求把样品制成溶液即可，非常适合于分离生物大分子、离子型化合物，不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。
此外，液相色谱的流动相不仅起到使样品沿色谱柱移动的作用，而且与固定相一样，与样品分子发生选择性的相互作用，这就为控制和改善分离条件提供了一个额外的可变因素。
而气相色谱法采用的流动相是惰性气体，对组分没有亲和力，仅起运载作用。
2.液相色谱特点高压、高速、高效、高灵敏度、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
3.高效液相相色谱仪的组成高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统。
4.流动相使用前必须脱气常用的脱气方法有：低压脱气法(电磁搅拌、水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气)、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。
5.梯度洗脱用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。
6.高压梯度(内梯度)：特点是先加压后混合，将溶剂用高压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。
低压梯度(外梯度)：特点是先混合后加压。
在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。
7.进样系统要求良好的密封性，最小的死体积，最好的稳定性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。
8.分离系统色谱柱是实现分离的核心部件。
由柱管和固定相组成。
柱管为直型不锈钢管。
一般色谱柱长5~30cm，内径4~5mm，凝胶色谱柱内径3~12mm，而制备色谱柱内径则可达25mm。
一般淋洗溶剂在进入色谱分离柱之前，先通过前置柱。
HPLC 柱的填料颗粒粒径一般约为3~10m，填充常采用匀浆法，色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
9.检测系统用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识一、液相色谱原理液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。
当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。
通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。
根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。
正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。
在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。
同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
2. 缺点：液相色谱需要使用有机溶剂作为流动相，可能对环境和人体健康造成一定影响。
此外，液相色谱的设备成本较高，操作复杂度也相对较高。
六、液相色谱仪器设备液相色谱常用的仪器设备包括高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、质谱仪等。
其中，高效液相色谱仪是实现液相色谱分离的核心设备，它包括泵、进样器、色谱柱、检测器等部分。
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最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）流动相a、流动相对样品具有一定的溶解能力b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
1.流动相必须用HPLC级的试剂.2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。
种被污染的溶剂如用于HPLC 系统，可能造成柱效降低。
贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。
因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，可采用Millipore滤膜（0.2um 或0.45um ）等滤器。
泵的入口都应该连接砂滤棒（或片），输液泵的滤器应经常换。
2、流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是停泵过夜或更长时间的情况下。
如果将含有缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静止，就可能析出盐的微小晶体，些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。
因此，必须泵入纯水充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合固定相，可以是甲醇或甲醇和水）。
3、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转也磨损柱塞、密封环或缸体，最终产生漏液。
4、输液泵的工作压力不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
5、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大喊大量气泡，泵就无法工作。
二、如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应的措施排除故障：1、没有流动相流出，又无压力指示。
原因可能是泵内有大量的气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大的流量（5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一50ml的注射器在泵出口处帮助抽出气体。
另一个原因可能是密封环磨损，需更换。
2、压力的流量不稳。
原因可能是气泡，需要排除，或者是单向阀内有异物，可以卸下单向阀，浸入丙酮内，进行超声清洗。
有时有可能是砂滤棒内有气泡或被盐的微小晶体粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，卸下砂滤棒浸入流动相内，超声除气泡，或将砂滤棒（片）浸入稀酸（如4mol/L 硝酸）内迅速除去微生物或将盐溶解，再立即清洗。
3、压力过高的原因，是管路被堵塞，需要清除或清洗。
压力降低的原因则可能是管路有泄漏。
检查堵塞或泄漏时可以逐段进行。
2、新柱柱效低柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好，影响传质过程。
-换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积。
使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。
5、新柱接到仪器上后，柱头漏液。
柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。
-用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。
6、新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降。
柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。
-继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。
7、新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。
柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。
-继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。
流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。
-配好流动相后一定要进行脱气处理。
8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。
柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。
-更换或清洗柱入口滤片；用0．45μm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。
3、旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷。
填料被流动相溶蚀而流失。
-用同型填料填补柱效可部分恢复。
对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。
4、旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。
入门填料被污染变质所致。
-用强溶剂冲洗。
刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。
污染严重，则废弃或重新填装。
9、[b]进样次数增加柱压降逐渐增加。
①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。
②样品在流动相中析出微小结晶。
①用0．45μm过滤膜过滤样品。
②推荐使用流动相溶解样品。
10、使用—段时间后，柱效下降，分离不好。
①柱填料被流动相溶解而流失。
②柱填料被样品杂质污染。
①推荐使用予柱。
如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。
②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。
11、[b]柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。
柱入口床层被污染使柱填料变质。
用强溶剂冲洗除去杂质。
12、柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。
柱入口床层被污染。
用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。
13、进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。
样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。
①用流动相溶解样品。
②样品的浓度不宜太大。
④进样量不宜过大。
14、使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。
霉菌生长所致。
①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。
②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。
15、用5μm颗粒填料柱时，以MeOH／H20作流动相柱压较高。
MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。
可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。
16、长时间放置的色谱柱，出现双峰。
柱床层出现干裂。
柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。
17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。
强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。
不影响柱的性能。
18、柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。
柱中固定相流失所致。
①更换色谱柱。
②检查所用的色谱条件是否合适。
19、在U V色谱图中，靠近死时间处出现负峰。
①进样时压力波动所致。
②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。
①采用阀进样。
②用流动相溶解样品。
HPLC灵敏度不够1、样品量不足，解决办法为增加样品量2、样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3、样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器4、检测器衰减太多。
调整衰减即可。
5、检测器时间常数太大。
解决办法为降低时间参数6、检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗。
7、检测池中有气泡。
解决办法为排气。
8、记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可。
9、流动相流量不合适。
调整流速即可。
10、检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
为什么HPLC柱柱压过高1、拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。
时，如果柱压仍不下降，再检查；4、换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，在进样器与保护柱之间接一在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化漂移现象1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象1.流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3、流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合HPLC 仪器问题1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞；流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。
2、基线不稳，上下波动或漂移的原因是什么，如何解决？答：a.流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气b.单向阀堵塞；取下单向阀，用超声波在纯水中超20分钟左右，去处堵塞物c.泵密封损坏，造成压力波动；更换泵密封d.系统存在漏液点；确定漏液位置并维修f.柱后产生气泡；流通池出液口加负压调整器g.检测器没有设定在最大吸收波长处；将波长调整至最大吸收波长处h.柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
3、接头处为何经常漏液，如何处理？答：接头没有拧紧；拧松后再紧，手紧接头以手劲为限，不要使用工具，不锈钢接头先用手拧紧，再用专用扳手紧1/4-1/2圈，注意接头中的管路一定要通到底，否则会留下死体积。
接头被污染或磨损；建议更换接头。
接头不匹配，建议使用同一品牌的配件。
4、进样阀漏液是如何造成的？答：a.转子密封损坏；更换转子密封b.定量环阻塞；清洗或更换定量环c.进样口密封松动；调整松紧度d.进样针头尺寸不合适，一般是过短；使用恰当的进样针（注意针头形状）e.废液管中产生虹吸；清空废液管谱图问题1、问：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？答：a.筛板阻塞；反冲色谱柱、更换进口筛板 b.色谱柱塌陷；填充色谱柱 c.有干扰物质的存在；使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱 e.流动相PH值不合适；调整PH 值，对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰 f.样品与填料表面的溶化点发生反应；加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂或更改色谱柱2、问：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保护柱或分析柱污染；取下保护柱再进行分析。