淋巴细胞 分离方法

１０５２　

［文章编号］１０００—２２００（２０１３）０８—１０５２－０４　Ｊ　Ｂｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄ　Ｃｏｉｌ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１３，Ｖｏ１．３８，Ｎｏ．８　

小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较　・技术与方法・　

孔晓明。金齐力，韦莉，王婷。范伟，朱翔，刘勇　

［摘要］目的：通过比较几种肝脏淋巴细胞分离方法得到的总淋巴细胞、Ｔ细胞、自然杀伤Ｔ细胞（ＮＫＴ　ｃｅｉｌｓ）及自然杀伤细胞　（ＮＫ细胞）的比例和细胞绝对数，明确各种方法的适用范围。方法：按照析因设计，将不放血（Ａ法）、摘眼球放血（Ｂ法）、体循　环灌流（Ｃ法）、摘眼球结合体循环灌流（Ｂ法＋Ｃ法）４种肝脏预处理方法和单浓度离心法（Ｉ法）、非连续密度梯度离心法（Ⅱ　法）２种Ｐｅｒｃｏｌ１分离方法进行全面组合，共获得８种组合条件，分离小鼠肝脏淋巴细胞，用流式细胞术检测各类型细胞比例。　结果：肝脏预处理方法中Ｂ法＋Ｃ法获得淋巴细胞比例最高，Ａ法获得淋巴细胞绝对数最高，Ｂ法获得的ＮＫＴ细胞和ＮＫ细胞　比例和细胞绝对数均最高；ＩＩ法获得的淋巴细胞、Ｔ细胞、ＮＫＴ细胞和ＮＫ细胞比例和细胞绝对数均高于Ｉ法。对于ＮＫＴ细胞　比例和ＮＫ细胞绝对数，肝脏预处理方法和Ｐｅｒｃｏｌｌ浓度之间有交互作用（Ｐ＜０．Ｏ１和Ｐ＜０．０５），其他均无交互作用（Ｐ＞０．　０５）。结论：采用摘眼球放血结合体循环灌流法，结合Ｐｅｒｃｏｌｌ非连续密度梯度法（３３％＋７０％），可获得较高数量和比例的固有　免疫细胞，有助于对肝脏固有免疫细胞如ＮＫＴ细胞、ＮＫ细胞等的研究。　［关键词］细胞分离；肝脏淋巴细胞；分离方法；Ｐｅｒｃｏｌｌ；析因分析　［中国图书资料分类法分类号］Ｒ　４４６．１１３　［文献标志码］Ａ　

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　

ＫＯＮＧ　Ｘｉａｏ—ｍｉｎｇ，ＪＩＮ　Ｑｉ—ｌｉ，ＷＥＩ　Ｌｉ，ＷＡＮＧ　Ｔｉｎｇ，ＦＡＮ　Ｗｅｉ，ＺＨＵ　Ｘｉａｎｇ，ＬＩＵ　Ｙｏｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，　Ｂｅｎｇｂｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｎｇｂｕ　Ａｎｈｕｉ　２３３０３０，Ｃｈｉｎａ）　

1、淋巴细胞的来源：

人淋巴细胞的方便来源是外周血

分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。

根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。

分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。

2、密度梯度离心法：

外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。

3、实验方法：

1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2）

2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）

3、20℃，1500r/min，离心30min

从上一次至下

稀释的血浆、血小板

PBMC

Ficoll

红细胞、粒细胞

4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。

5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。

6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。

7.适量的培养基重悬细胞 ，计数。 分离单个核细胞纯度为95%

淋巴细胞约占90%～95%

4、淋巴细胞高纯度化

(一)红细胞的去除

一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。

(二)血小板的去除

将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。

在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法

去除PBMC中混杂的血小板。

（三）单核细胞和粒细胞的去除

人外周血淋巴细胞分离液使用说明

人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。下面是使用该试剂的详细说明：

1. 实验准备：

- 准备干净的工作台和操作工具。

- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。

- 为实验准备足够数量的外周血样本。

2. 样本处理：

- 从被试者的外周血中采集适量的血液。

- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。

3. 样本离心：

- 将含有外周血的离心管放入离心机中。

- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。

4. 废液处理：

- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。

5. 细胞分离：

- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1

mL的细胞悬浮液。

- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。 - 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。

6. 细胞收集：

- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。

- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。

- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。

请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。

希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。

为获得高纯度淋巴细胞，必须进一步清除PBMC悬液中其他血细胞。

（一）去除红细胞：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。低渗裂解法是加1ml蒸馏水于沉淀的PBMC中，不超过1min，红细胞即快速裂解，立即加入等量的1.8%氯化钠溶液恢复为等渗状态，经洗涤即可去除红细胞。氯化铵处理法是在沉淀的PBMC中加入1ml 0.83%氯化铵溶液，轻轻振摇2min，即可裂解红细胞，经洗涤即可去除红细胞。

红细胞裂解液的制备：碳酸氢钾（KHCO3）1.0g；氯化氨（NH4Cl）8.3g；EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至1000ml，即工作液。

（二）去除血小板：通过离心洗涤，即可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清（FCS）梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。[将PBMC悬液洗涤2~3次后，常可去除绝大部分混杂的血小板。某些疾病状态下，外周血中血小板数量增多，常需通过胎牛血清（FCS）梯度离心才能去除过多的血小板，因FCS可让单个核细胞通过而阻止血小板通过。]

Place 3 ml FCS in a 15-ml centrifuge tube and carefully overlay with PBMC.

Centrifuge 15 min in a GH-3.7 rotor at 800 rpm (200 g), 18℃ to 20℃. Discard

supernatant, which contains platelets. Resuspend pellet in HBSS/FCS at 2-5×107 cells

per 1 to 2 ml. [Fetal calf serum (FCS; heat-inactivated 1 hr, 56℃)]

（三）去除单核细胞和粒细胞：

单核细胞的去除：①粘附去除法：单核细胞能粘附在塑料或玻璃的表面，而淋巴细胞则不能，由此可将单核细胞从PBMC悬液中分离出来。②L-亮氨酸甲酯去除法：单核细胞内富含溶酶体酶，而L-亮氨酸甲酯能被单核细胞摄入后聚集于溶酶体中，在溶酶体的作用下转化为L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯，此物对细胞有毒性作用，由此可溶解并去除单核细胞。此外本法还可清除NK细胞及细胞毒性T细胞，而B细胞及绝大多数T细胞因缺少溶酶体酶，因而不受影响。这种方法只适用于分离新鲜细胞，冻存细胞因代谢L-亮氨酸甲酯的能力很弱而不易分离。③羰基铁吞噬离心法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞比重增大，再经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，则单核细胞将沉于管底而被去除。实验时可先将抗凝血与一定量的羰基铁粉混合，在37℃下搅拌15min，亦可将已分离的PBMC悬液与羰基铁粉混合，然后再进行离心分离。此外，用针对单核细胞表面特殊标志的特异性抗体，通过间接免疫吸附法或免疫磁性微珠法亦可去除PBMC悬液中的单核细胞，且可对单核细胞进行回收利用。