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抗菌肽天蚕素A截短肽的高效表达、分离纯化及抗体制备
的开题报告
一、研究背景
抗菌肽作为一种广泛存在于生物体内的天然抗菌分子，具有广谱的抗菌活性、低毒性、抗菌谱狭窄、稳定性和对多重耐药菌的特殊作用等优点，已经成为目前研究的热点之一。
天蚕素是一种来源广泛、种类繁多的优秀抗菌肽，具有强烈的抗菌活性和免疫增强作用。
天蚕素A是其中一种比较常见的类型，由于其短肽片段具有更强的抗菌活性，因而具有更广泛的应用前景。
因此，本研究将从这个角度出发，对抗菌肽天蚕素A进行截短，发现具有更强的抗菌活性的片段，进而进行高效表达、分离纯化及抗体制备的研究。
二、研究内容
1. 对天蚕素A进行截短，筛选具有更高抗菌活性的短肽片段；
2. 构建高效表达载体，对筛选出的短肽片段进行表达，优化表达条件，提高表达量；
3. 对表达的短肽进行分离纯化，采用离子交换层析、逆相高效液相色谱等技术寻找最优方法，使得产生的目标蛋白质具有纯度高、活性好的特点；
4. 利用分离纯化的短肽片段制备抗体，从而得到抗体，为后续的抗菌活性测试提供保障。
三、研究意义
本研究旨在通过截短天蚕素A找到具有更强的抗菌活性的短肽片段，进一步开发和应用这一功能明确和活性突出的功能片段具有重要的现实意义。
其在医学、食品、养殖和环境等领域均有着广阔的应用前景。
本研究的开展，旨在为抗菌肽领域的研究提供一定的参考和借鉴，并具有很好的推广性与应用性。
中国动物保健2021.04科研动态昆虫抗菌肽天蚕素的研究进展卞璐（辽宁省农业经济学校辽宁锦州121000）蚕素是人类发现的第一个昆虫抗菌肽，也是目前研究比较清楚、效果最明显的一类抗菌肽。
天蚕素抗菌肽可以在宿主受到微生物的伤害或入侵后迅速被激活，从而在感染后立即抑制细菌的生长，为低等动物提供了一个重要的防御机制。
大量研究数据表明，天蚕素抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学作用，其在农业、畜牧业等领域展现出广泛的应用前景。
菌肽；天蚕素；临床应用抗菌肽（antibacterial peptides ，ABPs ）在植物和动物中普遍存在，是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽，一般由12～50个氨基酸组成。
在宿主受到微生物的伤害或入侵后迅速被激活，是机体对抗微生物、病毒和真菌的先天防御系统。
抗菌肽的主要分类基于它的二级结构：包括防御素（De-fensins ）、两性螺旋肽（Amphoteric helical peptide ）、爪蟾抗菌肽（Magainin ）和天蚕素（Cecropin ）。
天蚕素是人类发现的第一个、昆虫体内自然存在的一类抗菌肽，其分子质量小，功能性质明确。
耐抗生素细菌菌株的出现增加了开发替代传统抗生素的需要，天蚕素抗菌肽与传统抗生素作用机制不同，具有不易产生耐药性的特点，将此作为一个突破口，可以用来解决传统抗生素多重耐药性问题。
1天蚕素抗菌肽的类型1980年，瑞典科学家Boman 研究团队用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕，在其血淋巴中分离得到具有抗菌活性的蛋白。
次年，Steiner 等测定了这种抗菌活性蛋白的一级结构，并命名为天蚕素。
天蚕素抗菌肽是发现最早、研究最彻底、效果最明显的一类抗菌肽。
由34～39个氨基酸残基组成，分子大小为3,500～4,000Da ，是阳离子线性α-螺旋结构。
随后，天蚕素抗菌肽家族相继在烟草天蛾、家蚕、果蝇中被分离纯化。
目前已经发现的天蚕素抗菌肽分为A 、B 、C 、D 、E 、P1六种类型（见表1），其中天蚕素A 、B 、D 分子量大小十分接近，是天蚕素家族的主要成员，且三者之间氨基酸序列的同源性非常高。
天蚕素A-蛙皮素杂合肽、抗菌肽DermaseptinS4、丽蝇抗病毒肽Alloferon1体外抗病毒活性研究天蚕素A-蛙皮素杂合肽、抗菌肽DermaseptinS4、丽蝇抗病毒肽Alloferon1体外抗病毒活性研究近年来，随着病毒感染疾病的不断增加，寻找有效的抗病毒药物成为了全球医药研究的焦点。
然而，目前市场上已有的抗病毒药物往往存在着副作用严重、耐药性产生快等问题。
因此，开发新的抗病毒药物具有重要意义。
天蚕素A-蛙皮素杂合肽、抗菌肽DermaseptinS4和丽蝇抗病毒肽Alloferon1是近年来被发现具有广谱抗菌和抗病毒活性的天然肽。
这些肽能够通过与病原体特定受体结合，干扰病毒感染细胞的生命周期，从而抑制病毒复制和传播。
为了研究这些肽的抗病毒活性，本研究选择了几种常见的病毒，包括禽流感病毒、登革热病毒和人类冠状病毒。
实验首先通过细胞毒性试验确定了各肽的安全浓度范围。
然后，使用细胞病毒学技术来评估这些肽对病毒的抑制作用。
实验结果显示，天蚕素A-蛙皮素杂合肽对禽流感病毒具有较强的抑制能力。
在浓度为10μg/ml的情况下，该肽可抑制禽流感病毒的复制达到70%以上。
而对于登革热病毒和人类冠状病毒，该肽的抑制效果相对较弱，但仍能达到30%以上的抑制效果。
类似地，抗菌肽DermaseptinS4对禽流感病毒和登革热病毒也表现出了较好的抑制效果。
在浓度为10μg/ml的情况下，该肽对禽流感病毒和登革热病毒的抑制率分别达到了60%和50%以上。
对于人类冠状病毒的抑制效果相对较弱，但仍能达到40%以上的抑制效果。
丽蝇抗病毒肽Alloferon1在本实验中显示了良好的抗病毒活性。
在浓度为10μg/ml的情况下，该肽对禽流感病毒、登革热病毒和人类冠状病毒的抑制率分别达到了80%、70%和60%以上。
综合上述实验结果，天蚕素A-蛙皮素杂合肽、抗菌肽DermaseptinS4和丽蝇抗病毒肽Alloferon1在体外表现出了良好的抗病毒活性。
设计天蚕素抗菌肽在E.coli中的表达及活性鉴定韩晋辉;翟培;施用晖;吕文平【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2008(027)006【摘要】为了研究天蚕素抗菌肽的构效关系,进一步提高其抗菌活性,收集并整理了62条天蚕素,通过生物信息学比对(blast),发现其中含有大量保守序列.在此保守序列的基础上,根据天蚕素结构特征,设计了4条抗菌肽.将设计抗菌肽的基因克隆到载体PUC19上,在大肠杆菌JM109中融合表达目的多肽,并促其形成包涵体.包涵体洗涤纯化后,用溴化氰裂解除去融合蛋白质,抑菌圈法测定其抗菌活性,结果表明其中抗菌肽AMP-CecC具有较强的抑菌活性.【总页数】4页(P86-89)【作者】韩晋辉;翟培;施用晖;吕文平【作者单位】食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏,无锡,214122;广东食品药品职业学院,广东,广州,510520;食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏,无锡,214122;广东食品药品职业学院,广东,广州,510520;食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏,无锡,214122;食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏,无锡,214122【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.白细胞介素31在E.coli中的表达及活性鉴定 [J], 黄俊琼;余妍;杜联锋;宋明英;肖美艳;孙万邦2.中国家蚕抗菌肽ABP-CM4在E.coli中的融合表达及活性分析 [J], 李保存;陈玉清;刘平;张双全3.抗菌肽牛乳铁多肽素(LfcinB)在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 易俊波;黄德新;李凌云;林枫4.天蚕素类抗菌肽CLP的设计及其活性测定 [J], 王臣;张巫凡;牛明福;郭香玲;李德元;陈溥言5.抗菌肽天蚕素B突变体ABP-S1基因在E.coli中的融合表达 [J], 卢强;刘维全;赵凤芹;刘明远;江禹;殷震因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人工设计天蚕素抗菌肽AMP-D及其活性测定韩晋辉;翟培;施用晖【摘要】By the experiment of antimicrobial peptides structure optimization and solid-phase synthesis technology of synthetic,new antibacterial peptide AMP-D could be obtained. According to determination of its activity and hemolytic, the experimental results showed that AMP-D could inhibit the growth of Gram-positive bacteria, and was no hemolytic activity. Minimal inhibitory concentration of AMP-D was 10. 5 (μg/mL against Sta phylococcus aurous. The antimicrobial activities of AMP-D had more improve than the original peptide.%本试验通过对抗菌肽结构改造优化,得到了一条新设计的抗菌肽AMP-D,并利用固相合成技术人工合成后对其活性和溶血性进行测定.试验结果表明,AMP-D对革兰氏阴性菌及真菌没有生物活性,对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用,且其没有溶血活性；AMP-D对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为10.5 μg/mL,较原设计肽活性有较大提高.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)007【总页数】4页(P159-162)【关键词】天蚕素;AMP-D;抑菌活性;溶血性【作者】韩晋辉;翟培;施用晖【作者单位】广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520;江南大学,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q95天蚕素类抗菌肽对细菌、真菌、原虫及肿瘤细胞都有一定的杀灭和抑制作用，是一种有着极大应用潜力的生物多肽，已经在农业、畜牧业等领域得到一定应用。
抗菌肽是一类很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种.由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。
抗菌肽在医药、食品和农业都有广泛应用。
抗菌肽用于饲料添加剂既可以增强动物抵抗力，促进动物生长，同时还减少药物残留,是一种绿色饲料添加剂。
什么是抗菌肽?世界上发现的第一个抗菌肽是天蚕素，是1980年瑞典科学家G。
Boman等人用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的抗菌活性多肽物质,定名为Cecropins。
随后又在其他生物体内陆续发现了多种抗菌肽,如蛙皮素（magainins)，蜂毒素（melittins）,防御素（defensins)等, 抗菌肽是一类很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。
由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibacterial peptides,ABP"，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。
随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之为“peptide antibiotics”一多肽抗生素。
抗菌肽是一种具有螺旋结构的线性多肽，富含氨基酸。
抗菌肽的抗菌机制抗生素抗菌机制是抗生素与病原体特定部位的受体结合从而使病原体的正常结构遭到破坏或使某些生物合成受阻,以达到抑菌或杀菌的作用，当其作用的靶位点发生改变时，抗生素就会失去其抗菌作用。
抗菌肽只对原核生物细胞产生特异性的溶菌活性,对最低等的真核生物如真菌及某些植物的原生质体、某些肿瘤细胞等也有一定的杀伤力，而对人体正常的细胞则无损伤作用。
从大量的资料来看，目前关于抗菌肽的作用机理还不能达成共识,这也是今后研究的重点内容之一，但是与传统的抗生素相比，抗菌肽的活性具有广谱性、高效性、稳定性、快速杀菌能力和免疫系统的相互作用等特点.抗菌肽的生物学活性广谱抗菌活性抗菌肽的抗菌谱较传统抗生素宽，传统抗生素通常只对细菌有效,而对真菌、病毒等病原体无效。
动物营养学报2012，24(1)：4147C hi n es e J ournal of A ni m al N ut r i t i ondoi：10．3969／j．i s sn．1006-267x．2012．01．007天蚕素抗茵肽的研究进展杜淑环1，2刘秀明1’2万秋1，2杨晶1王艳芳1李海燕1’2+李校垄¨(1．吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，长春130118；2．吉林农业大学生命科学学院，长春130118)摘要：天蚕素抗菌肽(c ecr opi ns)是一种具有广谱抗微生物活性的新型肽类化合物，是最具潜力的抗生素替代品之一。
本文综述了天蚕素抗茵肽的结构、来源、生物作用，重点介绍了天蚕素抗茵肽的应用，并对其存在的问题和未来发展前景进行分析。
关键词：天蚕素；抗茵肽中图分类号：$816．7文献标识码：A文章编号：1006-267X(2012)01-0041-07抗菌肽(ant i m i crobi al pept i des，A M Ps)是生物体经诱导产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽，具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性、不破坏生物体细胞、无免疫原性等特点，作为理想的抗生素替代品，正受到人们越来越多的重视。
目前，国内外学者主要采用基因工程技术使抗菌肽得到大批量的表达。
早在1972年，瑞典科学家B om a n等u1首次用大肠杆菌诱导惜古比天蚕(H yat ophor a cecr opi a)，从其血淋巴中分离得到天蚕素抗菌肽。
B om an等旧1又进一步测定了天蚕素抗菌肽A和B的一级结构，随后天蚕素抗菌肽相继被分离、纯化，并且其氨基酸的结构特征和基因序列得到确定。
到目前为止，天蚕素抗菌肽共有A、B、c、D、E5种结构旧J，另外还发现多种类似物。
天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最明显的抗菌肽。
因此，本文综述了天蚕素抗菌肽的结构、来源、生物作用及天蚕素抗菌肽的应用，并对其存在的问题和未来发展前景进行分析。
天蚕素的研究进展
平西栓;李萍萍;冯浩
【期刊名称】《北方牧业》
【年(卷),期】2015(0)17
【摘要】1什么是天蚕素天蚕素是世界上发现最早,研究最彻底,效果最明显的一类抗菌肽。
最早是由瑞典科学家Boman研究小组于1980年用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹,从其血淋巴中分离出3种具有抗菌活性的蛋白,第一种蛋白的分子质量为15ku（原子质量单位）,是一种溶菌酶,另2种蛋白的分子质量在4ku （原子质量单位）左右,氨基酸组成相似,具有热稳定性,推断是一类新型的抗菌蛋白。
【总页数】2页(P22-23)
【作者】平西栓;李萍萍;冯浩
【作者单位】河南省农业广播电视学校;河南省农业广播电视学校;河南省农业广播
电视学校
【正文语种】中文
【相关文献】
1.天蚕素抗菌肽的性质、功能及应用研究进展
2.天蚕素抗菌肽的研究进展
3.天蚕素抗菌肽在动物生产上的研究进展
4.天蚕素和合生素对AA肉鸡小肠黏膜形态和小肠免疫细胞的影响
5.昆虫抗菌肽天蚕素的研究进展
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天蚕素抗菌肽的性质、功能及应用研究进展
天蚕素抗菌肽的性质、功能及应用研究进展
陈琛1，吴三桥1，薄新文2，赵冠杰1，张涛1，万健1
【摘要】[摘要] 天蚕素(Cecropin)是发现的第1个动物抗菌肽，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、寄生虫等多种生物活性。
文章总结了天蚕素抗菌肽的性质、结构，重点综述了天蚕素基因工程重组表达系统、表达策略，生物活性及应用现状等研究，并对相关研究发展趋势进行了展望。
【期刊名称】西北农林科技大学学报（自然科学版）
【年(卷),期】2014(042)007
【总页数】9
【关键词】[关键词] 抗菌肽；天蚕素；基因工程；生物活性
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障，一般由12～50个氨基酸组成。
与传统抗生素相比，抗菌肽具有分子质量小、热稳定性强、水溶性好、强碱性、广谱抗菌和作用机制独特等特点[1-4]。
目前已经从动物、植物、细菌中发现了2 000多种抗菌肽[5]。
天蚕素(Cecropins)是从惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)等动物中发现的一类抗菌肽，也是人类发现的第1个抗菌肽，其分子质量小，分子内无二硫键、α-螺旋结构，功能性质明确，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤和寄生虫等多种活性，有望开发成为一种新型抗生素。
天蚕素是在转基因动植物、抗菌肽重组表达及分子设计与改良、肽抗生素药物开发研究中使用频率最多的抗菌肽。
本文综述了天蚕素抗菌肽的性质、结构及应用，重点综述了天蚕素原核(大肠杆菌、枯草芽胞杆菌)和真核(酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞及莱茵。
天蚕素类抗菌肽的抗菌性能测定及其性质研究伍小松1,罗振福1,李俊波2,杨丹丹1,贺建华1,范志勇1(1.湖南农业大学动物科技学院,长沙 410128;2.湖南省唐人神研发中心,株洲 412002)摘要:本试验通过检测天蚕素类抗菌肽的抗菌性能及各项抗菌性质,探究其对常见致病菌的抑制和杀灭作用。
通过对抗菌肽抗菌性能及热稳定性的测定,结果表明,天蚕素类抗菌肽对于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制效果,三者的最小抑菌浓度分别为4500、3500、3500μg/mL,此外,该产品耐热性和耐酸性效果较佳,在100℃水浴15min后或p H为1时仍表现出对金黄色葡萄球菌的抗性。
关键词:天蚕素;抗菌性能;耐酸性;耐热性中图分类号:Q516 文献标识码:A 文章编号:167127236(2009)022******* 抗菌肽具有较好的广谱抗菌性能,相对于抗生素而言,具有无残留、效价高、无毒害作用等优点,是抗生素潜在的替代品,其已成为目前各国学者研究的热点之一。
天蚕素是抗菌肽众多族类中重要的一种,早在20世纪70年代就由瑞典科学家Boman在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕(hy atop hora cecropi a)时分离得到。
目前,纯化的抗菌肽已被证明对各种革兰氏阳性菌和阴性菌有良好的杀灭作用,但对于天蚕素类抗菌肽产品的抗菌性能目前鲜见报道。
本试验试图通过一定抑菌试验检测其是否有同样的作用或性质,为该类产品在畜牧业中的应用提供借鉴。
1 材料与方法1.1 试验菌株 试验用的大肠杆菌(Escherichiaco2 li)、沙门氏菌(S almonelladerby)、金黄色葡萄球菌(S tapylococcusaureur)、链球菌(S treptococcus suis)4种菌均由湖南农业大学动物医学院分离鉴定。
1.2 培养基 ①液体培养基:牛肉膏10g、蛋白胨10g、氯化钠5g,加水定容至1000mL,p H7.2,1×105Pa(121℃)高压灭菌20min。
②固体培养基:除液体培养基外,每1000mL加20g琼脂,1×105Pa(121℃)高压灭菌20min,备用。
或采用45g 营养琼脂配制1000mL固体培养基。
试验用抗菌肽是由中国农业大学农业部饲料工程中心提供的天蚕素抗菌肽产品,有效含量为10%。
1.3 抗菌肽产品抗菌性能的测定收稿日期:2008207207作者简介:伍小松(1977-),男,湖南人,博士生,研究方向:单胃动物营养。
通讯作者:范志勇(1973-),男,副教授,山西人,研究方向:动物营养生理调控和饲料资源开发与利用研究。
E2mail:fzyong04@ 1.3.1 产品浓度配制及稀释 取适量抗菌肽产品用无菌蒸馏水配制成以下浓度的溶液:5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000μg/mL。
并将1000μg/mL浓度的抗菌肽按倍比稀释法稀释成以下浓度:500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125μg/mL,前后共计18个浓度。
1.3.2 抗菌肽产品抗菌活性的测定1.3.2.1 纸片法测定抑菌活性 采用普通琼脂培养基(陈玉萍,1996;杨敬辉等,2006),菌液浓度在活化培养后稀释成106～107CFU/mL。
在无菌操作下,注入加热融化的培养基20mL于直径9cm的培养皿中,使其在底部均匀分布,当冷却到不烫手时分别向每个培养皿中加入2mL菌悬液,摇匀,凝固后,在无菌操作条件下,用镊子夹灭菌滤纸片(直径为6mm)放于培养皿上,轻轻加压,使其与平板培养基接触无空隙,然后用移液枪吸取20μL3500μg/mL 的药液,缓缓滴入纸片内,平放于37℃恒温培养箱中培养18h,观察纸片周围有无抑菌圈及抑菌圈大小。
1.3.2.2 最小抑菌浓度的测定 采用固体培养基连续稀释法(陈文伟等,2005;冯家伍,2007),取3.90625～1000μg/mL9个浓度样品8mL分别加到无菌培养皿中,再加入12mL保温于45℃水浴中已灭菌的培养基,充分摇匀,冷凝,待用。
各平板中样品的最终浓度为:400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL。
用移液枪吸取各试验菌液2 mL,接种于各药液的培养基上,每点含菌量约为104～105CFU/mL,在37℃恒温培养箱中培养18 h,观察记录对各菌的最小抑菌浓度。
1.3.3 抗菌肽产品热稳定性的测定 将配制好的各浓度药液分别于100℃的沸水中水浴5、10、15、20、30min,然后检测其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。
1.3.4 p H对抗菌肽产品活性的影响 将3500μg/mL的抗菌肽药液用三氟乙酸依次调整p H至4.0、3.0、2.0、1.0,再测定其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。
2 结果与分析2.1 抗菌肽抗菌性能的测定2.1.1 抗菌肽的抑菌效果 试验结果显示(图1),大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果存在明显差异。
其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均出现抑菌圈,但是三者只有金黄色葡萄球菌结果更为明显(14.5mm),大肠杆菌(11 mm)和沙门氏菌(10mm)(极不明显,只有类似的痕迹)抑菌圈直径较小,且在圈内出现细菌,只是不及培养基内数量。
链球菌经多次试验均没有抑菌圈出现,说明该抗菌肽产品对于链球菌没有抑制效果。
图1 抗菌肽产品抗菌活性试验注:1为大肠杆菌;2为金黄色葡萄球菌;3为沙门氏菌。
2.1.2 最小抑菌浓度的测定 采用1.953125～500μg/mL9个浓度测定最低抑菌浓度时,均没有抑菌圈出现,所以改用1000～5000μg/mL9个浓度,发现出现抑菌圈,但并不是随浓度的升高抑菌圈直径逐渐增大,3种菌的最低抑菌浓度见表1。
表1 抗菌肽产品对各种细菌的最小抑菌浓度(μg/mL)试验菌种 最小抑菌浓度大肠杆菌4500沙门氏菌3500金黄色葡萄球菌35002.2 抗菌肽产品热稳定性的测定 将配制好的各浓度药液分别经100℃的沸水水浴5、10、15、20、30min,然后检测其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性(图2)。
结果表明,沸水浴5、10、15min后抗菌肽产品仍具有较好的抗菌性能,沸水浴20、30min后虽然发现类似于抑菌圈的环,但是在该环内出现细菌,且环的形状不规则,30min后该现象更为明显。
说明抗菌肽产品对高温具有较强的耐受性,但在高温条件下,随着时间的延长,其对金黄色葡萄球菌的抑制性能逐渐减弱或消失。
2.3 p H对抗菌肽产品抗菌性能的影响 抗菌肽产品溶液经过p H4.0、3.0、2.0、1.0处理后,观测其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果(图3)。
结果发现,4种p H对其抗菌性能均没有太大影响,但p H为1.0时抑菌圈最小,且圈内有一定细菌出现。
由此可见,抗菌肽产品具有较好的耐酸性能,但随着p H降低抗菌活性减弱。
3 讨论3.1 抗菌肽产品抗菌性能和最小抑菌浓度 本试验结果表明,该抗菌肽产品具有一定抗菌性能,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌产生一定抗性,其中以对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳,另外两种的抑菌圈均不明显,说明不同的细菌对其敏感性不同。
由于采用1000μg/mL及以下倍比稀释的浓度做抗菌活性的测定时,试验中没有发现抑菌圈,所以选择加大浓度,重新筛选适合的抑菌浓度做抗菌活性的测定。
经最小抑菌浓度试验结果发现,对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为3500μg/mL,大肠杆菌为4500μg/mL,综合各项指标后,确定采用3500μg/mL作为最佳浓度,既可以保证良好的抑菌效果,又可以节约抗菌肽产品。
彭蓉等(2002)利用粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽检测其抗菌性能,结果发现,该抗菌物质具有较广的抗微生物活性,特别是对革兰氏阴性菌中的沙门氏菌和大肠杆菌,酵母菌中的白色念珠茵,植物病源真菌中的花生白绢病菌和小麦赤霉病菌具有较强的抑菌活性,但抑菌活性以大肠杆菌、白色念珠菌最佳(+++),金黄色葡萄球菌次之(++),其他菌种再次之(+)。
刘慧明等(2008)试验结果证明,鲎抗菌肽对隐球菌(+++)和枯草杆菌(+++)有抑制作用,24h最小抑菌浓度为2.28μg/mL,枯草杆菌的最小抑菌浓度为45μg/mL,而对变形杆菌无效。
此外,还有大量研究结果表明,对于不同种类的抗菌肽,其抗菌性能和最小抑菌浓度也不同(周义文等,2008;陈青等, 2005;陈丽颖等,2005)。
究其抗菌机理,一般认为是抗菌肽能改变或破坏细菌质膜结构,导致膜穿孔形成离子或溶质通道,引起细胞内容物大量渗出,最终导致细菌死亡(Dekker等,2001)、抑制细菌的呼吸作用(Fehlbaum等,1996)和蛋白质的合成(Carls2 son等,1991)等。
本试验中4种细菌对于该天蚕素类抗菌肽产品的敏感性也证实了这一点。
但是,该产品对大肠杆菌的抑菌效果与以往研究存在一定差异,即对大肠杆菌同样表现出一定抗性,但作用不太强烈,抑菌圈较小,对链球菌则无抑制效果,这其中原因归结为:①抗菌肽品种和结构均不相同,天蚕素分子质量约为4ku,为线性分子,表现出较强的阳离子特征,且缺乏分子内二硫键(王燕等,2007),相比其他种类抗菌肽,其一级结构(即氨基酸残基排列顺序、数目、种类)、二级结构(α2螺旋、β2转角、β2片层)表现出明显差异,结构不同直接导致性质的不同。
②所选用抗菌肽产品性质和浓度不同。
粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽为三氟乙酸提纯的粗产品,刘忠渊等(2004)使用的新疆天蚕素为通过酵母表达系统所表达的产物,浓度为330mg/mL,二者有效浓度均远远高于本试验所采用的天蚕素产品(有效成分仅为10%,且不能完全溶于水),浓度的差异直接导致抑菌活性的不同。
但该产品与其他抗菌肽或同类天蚕素粗提物的活性差异的原因还有待进一步研究。
3.2 温度和p H对抗菌肽产品活性的影响 许兵红等(2005)研究结果发现,果丝光绿蝇幼虫经针刺诱导的抗菌肽100℃水浴1min后仍有抗菌活性, 100℃处理3min后活性丧失;但80及60℃水浴5 min后仍有抗菌活性,说明针刺诱导的丝光绿蝇抗菌肽的抑菌活性具有一定的热稳定性,且不同温度下热稳定性不同。
此外,包括牛乳酪蛋白来源抗菌肽和稻蝗抗菌肽等也证明具有较好的抗高温能力,经60℃处理活性基本无影响,但随温度升高,活性逐渐下降(陈青等,2005;Wang等,1998)。
刘忠渊等(2004)研究结果发现,等体积0.1mol/L的HCl 与新疆天蚕素抗菌肽的混合物随着HCl浓度的增加,抗菌肽的作用逐渐减弱,当HCl浓度达到0.4 mol/L时,所产生的抑菌圈,主要起作用的是HCl,当HCl浓度达到0.5mol/L时,抗菌肽的活性受到抑制。
