蛋白质水解度测定方法综述
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蛋白质水解度的简易测定方法
蛋白质水解度的简易测定方法蛋白质水解度是指蛋白质在特定条件下被水解的程度。
测定蛋白质水解度的主要方法之一是采用“肽键长度”测定法。
以下是测定蛋白质水解度的简易方法及步骤：一、准备相关试剂和器材1.蛋白质溶液：你需要准备一定浓度的蛋白质溶液，以便进行后续的测定。
2.氢氧化钠溶液：用于中和蛋白质溶液中的酸。
3.茚三酮溶液：用于与肽键发生反应，生成紫色产物。
4.醋酸溶液：用于调节溶液的pH值。
5.滴定管和滴定剂：用于滴定蛋白质溶液中的游离氨基。
二、测定步骤1.调节溶液的pH值：用醋酸溶液调节蛋白质溶液的pH值至4.5～5.0之间。
这个pH范围是蛋白质中肽键与茚三酮反应的最佳条件。
2.加入茚三酮：向蛋白质溶液中加入一定量的茚三酮溶液，充分混合后静置10～15分钟。
3.加热：将混合液加热至100℃左右，保持加热状态数分钟，使反应完全。
4.中和：待混合液冷却后，用氢氧化钠溶液调节pH值至9～10之间，使混合液呈现碱性。
此时，未水解的氨基与茚三酮反应生成的产物会转变为黄色。
5.滴定：使用滴定管，用已知浓度的盐酸滴定混合液中的游离氨基，直至颜色变化为粉红色。
这个过程需要耗费一定的时间。
6.计算肽键长度：通过滴定所消耗的盐酸浓度和体积，可以计算出混合液中游离氨基的浓度。
再根据蛋白质中氨基酸的结构通式，可以计算出肽键长度。
三、注意事项1.在调节pH值时，要注意细致地使用精密的pH试纸或酸度计进行测量，以保证结果的准确性。
2.在加入茚三酮后，要充分混合并静置一段时间，以确保反应完全。
3.在加热过程中，要确保混合液受热均匀，并保持适当的加热时间以确保反应完全。
4.在滴定过程中，要保证滴定管的清洁度，避免因滴定剂污染而影响结果的准确性。
同时，需要多次摇晃混合液，以确保滴定剂与游离氨基充分反应。
5.在计算肽键长度时，需要考虑到蛋白质中不同氨基酸的构象和结构通式。
同时，还要注意温度和离子强度等因素对肽键长度的影响。
综上所述，测定蛋白质水解度的简易方法是可行的。
蛋白质水解度测定方法综述
蛋白质水解度测定方法综述
徐英操;刘春红
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2007(028)007
【摘要】对目前国内外常用的蛋白质水解度测定方法进行了综述,其中pH-state 方法是通过滴定水解过程中释放的质子测定DH;OPA、TNBSCLOt内常用的水合茚三酮和甲醛等测定方法是利用游离氨基的反应测定DH.
【总页数】4页(P173-176)
【作者】徐英操;刘春红
【作者单位】东北农业大学理学院应用化学系,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学理学院应用化学系,黑龙江,哈尔滨,150030
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.核桃蛋白水解物水解度测定方法比较 [J], 周慧江;朱振宝;易建华
2.蛋白水解物水解度测定方法的研究 [J], 罗艳华;王全杰;陈沛海;高翔
3.蛋白质水解度的测定方法研究 [J], 杨文博;张英华
4.蛋白质水解度的简易测定方法 [J], 袁斌;吕桂善;刘小玲
5.氨基酸配方及蛋白质水解配方特殊医学用途婴儿配方食品中氯测定方法的比较研究 [J], 田洪芸; 李恒; 任雪梅; 张海红; 王文特; 傅俊青; 吴鸿敏
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蛋白质水解物水解度的测定
蛋白质水解物水解度的测定
蛋白质水解物水解度是指蛋白质的分解能力，反映其特定化学和物理状态的能力。
它是饮食营养研究，氨基酸、肽链分离研究，腺体功能研究以及蛋白质工程及其他各种研究的重要指标。
因此，测定蛋白质水解物水解度对科学技术和医药卫生研究有着重要的意义。
蛋白质水解物水解度的测定主要是利用蛋白质的有机化学性质，用吡咯烷醇法、酸碱回流法或乙溴脩乙腈法等有效分析方法进行测定，因而在分析中不仅要测定蛋白质溶液中含有量有多少，还要根据技术参数判断抽样物质的水解情况。
吡咯烷醇法测定蛋白质水解物水解度通常是先用乙酸乙酯将抽取物中粗品脂肪
酯化，然后用硫酸银电泳池分别测定溶液中的可混溶蛋白和不混溶蛋白，最后利用其峰图的光谱图所显示的结论，来评定蛋白质水解物的水解度。
酸碱回流法测定蛋白质水解物水解度，主要是用恒定pH值的溶液将抽取物溶解，通过混合溶液中可溶蛋白和不溶蛋白，在紫外分光光度计上测定混合液中可溶性蛋白含量，来评价蛋白质水解物的水解度。
乙溴脩乙腈法测定蛋白质水解物水解度，主要是先使抽取物经过乙溴脩乙腈处理，将不溶性蛋白和其有机混合物分流，再用阴离子交换树脂将其树脂柱状分离，最后通过吸光度光谱测定乙溴脩乙腈处理后，抽样物质的可混溶蛋白含量，以评定其水解度。
以上是蛋白质水解质水解度测定方法，它是检测蛋白质结构及其分解情况的有
效方法，是蛋白质工程与医药生物技术研究的重要参考。
因此，正确准确的测定技术必须被正确使用，以确保研究成果的可靠性。
蛋白质水解度的测定
取完全水解液 011 ml~ 110 ml 于 25 ml 比色管 中, 蒸馏水稀释至 410 ml, 加 pH8 缓冲溶液 110 ml, 茚三酮溶液 110 ml, 混匀, 沸水浴加热 15 min, 冷却, 蒸馏水稀释至 25 ml。570 nm 测光密度( 水作参比) 。 另取 100 mg 蛋白, 加水 100 ml, 振荡均匀后过滤, 取 相应体积的滤液, 按上述方法测光密度值。相同体 积样品的光密度之差与蛋白质量做工作曲线, 取线 性部分做标准曲线。
参考文献
[ 1] Alder- Nissen J. Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by T rinitrobenzenesulfonic Acid [ J] . J. Agric Food Chem. , 1979, 27: 1256) 1262
[ 4] Qin- yun Chen. Effect of Amide contents in wheat gluten hydrolysates on the thermal flavor generation, ph. D. thesis, Rutgers university, U. S. A, 1995: 54) 56
茚三酮比色法( 完全水解液做标准) 1715 2413 2816
附图 不同方法测定的水解度
3 结果和讨论
311 结果 为了验 证此 种 方法 的可 行性, 本 研 究用 Fla-
vorzyme 对菜籽蛋白进行水解, 用同一种水解液采用 10% 三氯乙 酸沉淀法、甲醛滴 定法[ 2] 、茚三 酮比色 法[ 2] 和本文所介绍的方法分别进行测定, 结果见附 图和附表。 312 讨论
参考文献
[ 1] Alder- Nissen J. Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by T rinitrobenzenesulfonic Acid [ J] . J. Agric Food Chem. , 1979, 27: 1256) 1262
[ 4] Qin- yun Chen. Effect of Amide contents in wheat gluten hydrolysates on the thermal flavor generation, ph. D. thesis, Rutgers university, U. S. A, 1995: 54) 56
茚三酮比色法( 完全水解液做标准) 1715 2413 2816
附图 不同方法测定的水解度
3 结果和讨论
311 结果 为了验 证此 种 方法 的可 行性, 本 研 究用 Fla-
vorzyme 对菜籽蛋白进行水解, 用同一种水解液采用 10% 三氯乙 酸沉淀法、甲醛滴 定法[ 2] 、茚三 酮比色 法[ 2] 和本文所介绍的方法分别进行测定, 结果见附 图和附表。 312 讨论
蛋白质水解度的简易测定方法_袁斌
文章编号:10083464(2002)02011303蛋白质水解度的简易测定方法袁斌1,吕桂善2,刘小玲2(1深圳市成业冷冻有限公司,广东深圳518019;2广西大学生物技术与糖业工程学院,广西南宁530004)摘要:介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方法,该方法基于国外通用的pH ST A T 法,不需要特别的仪器,化学试剂耗量少,测定结果可靠,便于实验室和工业化生产使用。
关键词:蛋白质;水解度;pH ST A T 法中图分类号:T Q 936.1 文献标识码:AThe simple method of determining for the degree ofhydrolysis of proteinsYU ANG Bin 1,LU Gui shan 2,LIU Xiao ling2(1Shenzhen Cheng ye Freeze Cor por ation Limited,Shenzhen 518019,China;2Biotechnolog y and Sug ar Engineering Colleg e ,Guangx i U niv .,Nanning 530004,China )Abstract :A simple and w orkable method ,w hich w as based o n pH STAT method ,fo r deter-mining the deg ree of hydr olysis o f pro tein ,was intr oduced in the present paper.This metho d can be used in lab and food industry w ith g ood results and little reagents consumptions.Key words :pro tein;deg ree of hydr olysis;pH ST AT Method蛋白质是人体必不可少的营养素,在人体的代谢和生长过程中起着十分重要的作用。
蛋白水解度测定方法
蛋白水解度测定方法蛋白水解度（Protein Hydrolysis）是指蛋白质在特定的水解条件下被分解的程度。
测定蛋白水解度的方法有很多种，以下是其中几种常见的方法：1.肽图分析法（Peptide Mapping）肽图分析法是一种通过蛋白质在特定条件下水解得到的肽片段的分离和鉴定，来推断蛋白质序列和结构信息的方法。
该方法的原理是，不同的肽片段与固定相的结合能力不同，从而可以在色谱柱上分离出不同的肽片段。
通过对这些肽片段的分析，可以得到蛋白质的一级结构信息，进而计算出蛋白质的水解度。
2.游离氨基含量法（Free Amino Acid Content）游离氨基含量法是通过测定蛋白质水解液中游离氨基的含量，来计算蛋白质的水解度。
该方法的基本原理是，蛋白质水解后生成的游离氨基酸与某些特定的试剂反应，生成有色产物，通过测定有色产物的吸光度，可以得出游离氨基酸的含量。
根据游离氨基酸的含量，可以计算出蛋白质的水解度。
3.肽谱法（Peptide Mass Spectrometry）肽谱法是通过分析蛋白质水解液中肽片段的质量，来推断蛋白质的序列和结构信息。
该方法的基本原理是，不同的肽片段在质谱仪中碎裂后产生不同的离子峰，通过对这些离子峰的分析，可以得出肽片段的质量。
根据肽片段的质量，可以推断出蛋白质的序列和结构信息，进而计算出蛋白质的水解度。
4.生物化学法（Biochemical Methods）生物化学法是通过研究蛋白质在生物体内的代谢过程，来推断蛋白质的水解度。
该方法的基本原理是，蛋白质在生物体内的代谢过程受到许多因素的影响，如酶的活性、底物的浓度、代谢途径等。
通过对这些影响因素的研究，可以推断出蛋白质的水解程度。
5.免疫学法（Immunological Methods）免疫学法是通过检测蛋白质在生物体内的免疫原性，来推断蛋白质的水解度。
该方法的基本原理是，蛋白质在生物体内的免疫原性与其分子量、构象等因素有关。
乳清蛋白水解物水解度3种 测 定 方法的比较
乳清蛋白水解物水解度3种测定方法的比较下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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蛋白质水解度测定方法综述_徐英操
白的分子量，ｄ 指稀释因数，ε 指 ３４０ ｎｍ 处的摩尔消 光系数（６ ０００／ｍｏｌ·ｃｍ），Ｃ 指蛋白浓度（ｇ／Ｌ）。
Ｋａｎｇ Ｓ． Ｌｅｅ 等 利 ［１０］ 用荧光法测定游离氨基酸原 理，针对半胱氨酸与胱氨酸与邻苯二醛反应生成的
１／α 为 ２．２６；Ｍｐ：蛋白质的质量（ｇ）；ｈｔｏｔ：每克原料蛋白 质中肽键的毫摩尔数，对于酪蛋白，该值取 ８．２ ｍｍｏｌ／ｇ。 ２．２ 三 硝 基 苯 磺 酸 法 （Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ
ｂ１）
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法的优点在于操作简单、快速、可重复
２．３ 邻苯二甲醛（Ｏｒｔｈｏ－ ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ，ＯＰＡ）法 Ｃｈｕｒｃｈ 等［９］人首先于 １９８３ 年应用 ＯＰＡ 测定了蛋
性高，通常被用于水解度的连续测定。然而这种方法 白质水解度，ＯＰＡ 是在碱性介质中与游离氨基反应生
录下所用的碱液的量即可。具体方法如下：水解开始 表每个蛋白分子的肽键总数。ｎ 可用以下公式表示：
时，调节反应体系的 ｐＨ 为 ７．０，反应结束后测定反应 体系的 ｐＨ 值，用 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＯＨ 将反应体系的 ｐＨ
ｎ＝
ΔＡｂｓ×Ｍ×ｄ ε×Ｃ
调到原来的 ｐＨ，记录下所用的碱液的量，按下式即可 计算出酪蛋白的水解度：
计算如下：ＤＨ＝
１
Ａ ０００×Ｗ
×Ｖ１×１Ｖ０２０
×１００
式中：Ａ：查表得蛋白质的毫克数；Ｗ：称样重（ｇ）； Ｖ１：水解液的总体积（ｍＬ）；Ｖ２：显色时所用稀释液的体 积（ｍＬ）。 ２．５ 甲醛滴定法
［２］ Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ［Ｊ］． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８６ａ Ｌｏｎｄｏｎ
食用蛋白质水解度的改良测定方法
食用蛋白质水解度的改良测定方法摘要：当制备水解蛋白的时候，测定水解度（DH）是至关重要的。
已建立的三硝基苯磺酸（TNBS）发被认为是测定酶水解度的常用方法。
然为，三硝基苯磺酸法费时费力，不能连续的测定水解反应程度，并且需要使用有危险不安全的化学试剂。
本文阐述了一种基于基本氨基酸与邻苯二甲醛（OPA）反应的水解度测定方法。
结论是使用OPA法测定蛋白质的水解度更准确，方便，迅速，有更为广泛的使用范围，并且较之TNBS方法更环保。
关键词：水解度，食用蛋白，水解，蛋白质水解，测定介绍在蛋白质水解物当中，检测反应的一个关键参数就是水解度（DH）。
DH值呗定义为断开的肽键的百分比：DH=h/h tot*100%试中htot是每蛋白质当量中肽键总数，h是被水解的肽键数。
Htot是取决于原料的氨基酸组成。
在各种文献中，人们已经建立了几种测定蛋白质水解物DH值的方法，例如pH-stat法，渗压法，可溶性氮法以及三硝基苯磺酸（TNBS）法。
pH-stat法（Jacobsen 等，1957）测定DH值是基于一种基准物（或是由于水解物pH值变化产生的酸）来保持水解过程中的pH值。
基准物质的使用量与DH值是成比例的。
在实际的蛋白质水解试验中，Ph-stat法的使用仅限于pH略高于7的条件下（Adler-Nissen,1986）。
当水解反应的DH值达到约30%时，采用Ph-stat法来测定水解度并不经济可行，在pH>7的单一酶反应系统中使用该方法是不可取的。
这将使最适pH值低于7的酶不适用Ph-stat法。
另外，在水解反应当中添加基准物可能会导致最终产物的使用不尽如人意。
在水解反应当中，混合物冰点的降低值可以通过渗压计（冰点测定器）来测得。
这与DH值是相关的（Adler-Nissen,1984）.渗压法是一种可以在多种反应当中使用的快速方法。
这种方法的限制之处就在于它不能测定粘度大的溶液及溶质溶解度高的溶液，例如在长期反应当中作为防腐剂的盐。
蛋白质水解度的测定方法研究
三是需要特殊的仪器在线控制水解过程中的于三硝基苯磺酸法实验测定结果相对可靠但是实验所用的试剂不是很容易买到并且这种方法所需要的保温时间和冷却步骤比较长所以这种方法不能够对水解度tat法并不可取但tca法也有其优劣势本课题针对这三种方法进行探讨141甲醛滴定法测酪蛋白的水解度该方法是基于游离氨和甲醛结合ch2oh算出游离氨基的含量
蛋 白质是一种高营养化合物， 但是从对人体作用
来说， 它不 如氨基 酸利 于 人 体 的 吸收 ， 因此 ， 为 了提 高 蛋 白质 的功 效 ， 往 往 需要 将 其 水 解 。蛋 白质 这种 高 分
子 化合 物是 由无 数个 氨 基 酸通 过 肽键 缩 合 而成 ， 它 可 以通 过化 学方 法水解 ， 也 可 以通过 蛋 白酶 进 行 催化 水
Ｓ Ｏ ｔ ｈ ｉ ｓ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｉ ｓ ｎ ｏ ｔ ｄ ｅ ｓ ｉ ｒ ａ ｂ ｌ ｅ ．Ａｃ ｉ ｄ － ｓ ｏ ｌ ｕ ｂ ｌ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｃ ｏ ｎ ｔ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｂ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｂ ｙ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｌ ｏ —
关 键词 ： 甲醛滴定 法 ； 茚三 酮法 ； 三氯 乙酸法
中图分 类号 ： Ｔ Ｓ ２ ０ １ ． ２ １ 文献 标志码 ： Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ － ９ ９ ７ ３ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ ２ ２ 文章编 号ห้องสมุดไป่ตู้： １ ０ ０ ０ － ９ ９ ７ ３ （ ２ Ｏ １ ４ ） Ｏ ３ 一 ｏ ０ ８ ８ 一 Ｏ ３
（ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ，Ｎｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ３ ０ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
蛋 白质是一种高营养化合物， 但是从对人体作用
来说， 它不 如氨基 酸利 于 人 体 的 吸收 ， 因此 ， 为 了提 高 蛋 白质 的功 效 ， 往 往 需要 将 其 水 解 。蛋 白质 这种 高 分
子 化合 物是 由无 数个 氨 基 酸通 过 肽键 缩 合 而成 ， 它 可 以通 过化 学方 法水解 ， 也 可 以通过 蛋 白酶 进 行 催化 水
Ｓ Ｏ ｔ ｈ ｉ ｓ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｉ ｓ ｎ ｏ ｔ ｄ ｅ ｓ ｉ ｒ ａ ｂ ｌ ｅ ．Ａｃ ｉ ｄ － ｓ ｏ ｌ ｕ ｂ ｌ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｃ ｏ ｎ ｔ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｂ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｂ ｙ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｌ ｏ —
关 键词 ： 甲醛滴定 法 ； 茚三 酮法 ； 三氯 乙酸法
中图分 类号 ： Ｔ Ｓ ２ ０ １ ． ２ １ 文献 标志码 ： Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ － ９ ９ ７ ３ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ ２ ２ 文章编 号ห้องสมุดไป่ตู้： １ ０ ０ ０ － ９ ９ ７ ３ （ ２ Ｏ １ ４ ） Ｏ ３ 一 ｏ ０ ８ ８ 一 Ｏ ３
（ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ，Ｎｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ３ ０ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
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使用荧光光度计在吸收波长为 ３４０ ｎｍ 条件下测
法，采用本方法测定蛋白质水解度时，不需要经典的 定衍生物的荧光度。水解度的计算公式：
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法那样，对反应体系的 ｐＨ 值进行在线控制，
ＤＨ＝１００ｎ／Ｎ
而只需在水解结束后将反应体系的 ｐＨ 调至 ７．０，并记
式中：ｎ 代表牛乳蛋白水解后肽键的平均数，Ｎ 代
原料大豆中游离氨基酸进行测定，计算如下：
４ 小结
ＤＨ＝ 水解蛋白质的７－．８（ＮＨｍ２ｍ含ｏｌ量／ｇ）－ ０．３３（ｍｍｏｌ／ｇ）×１００ ％
其中：０．３３ 是原料大豆样品中游离氨基含量，可根 据自己样品测定值代入。
但是由于不同氨基酸和水合茚三酮显色不同，对 测量结果有部分偏差，例如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三 酮反应产生黄色物质，因其 α－ 氨基被取代，所以产生 不同的衍生物。郭兴凤［１３］利用待水解原料的完全水解 液作为标准， 消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产
蛋白质由不同的氨基酸通过肽键相连所组成，在 这些氨基酸中一部分可以由人体自己合成，称为非必 需氨基酸；而另外约有八种氨基酸必需由食物供给， 称为必需氨基酸。食物中如含有全部的必需氨基酸， 而且数量又多，这种食物蛋白质营养价值就高。但是， 存在一个问题，就是如何使蛋白质或氨基酸更有利于 人体的吸收，因此国内外通过对此进行大量的研究表 明：蛋白质通过水解，水解为二肽或三肽的产物在人 体内要比自由氨基酸易于吸收，比没有水解的蛋白质 更易于吸收［１］。因此在用不同的蛋白质酶对蛋白质进 行水解时，必须要对水解度进行测定。
在水解过程中，当肽键断裂后，就会有一个新的 － ＣＯＯＨ 和 － ＮＨ２ 形成，因此，水解肽键的数，就可以根 据水解后测定新形成的末端 － ＣＯＯＨ 或 － ＮＨ２ 基团的 量确定。
２ 水解度测定方法
２．１ ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法主要是基于蛋白质水解过程中，总是
要伴随质子的释放或吸收，质子化的多少，依赖于溶液
ｂ１）
ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法的优点在于操作简单、快速、可重复
２．３ 邻苯二甲醛（Ｏｒｔｈｏ－ ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ，ＯＰＡ）法 Ｃｈｕｒｃｈ 等［９］人首先于 １９８３ 年应用 ＯＰＡ 测定了蛋
性高，通常被用于水解度的连续测定。然而这种方法 白质水解度，ＯＰＡ 是在碱性介质中与游离氨基反应生
了详细的描述，水解样品的光密度可由下式求得：
３４０ ｎｍ 处有吸收峰的物质。反应是在弱碱性环境中， 在酸性中终止。水解度的计算公式下：
ＤＨ＝
ＡＮ２－ ＡＮ１ Ｎｐｂ
×１００
式中：ＡＮ１ 指蛋白水解前氨基氮的含量［ｍｇ／ｇ（ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ）］；ＡＮ２ 指 蛋 白 水 解 后 氨 基 氮 的 含 量 ［ｍｇ／ｇ（ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ）］；Ｎｐｂ 指蛋白底物中肽键的氮含量。ＡＮ１ 和 ＡＮ２ 的 值可由标样在 ３４０ ｎｍ 时的吸收曲线得知（标样一般采 用 Ｌ－ 亮氨酸）［７］。
Ｙ．Ｌ． Ｘｉｏｎｇ 等［８］引用 Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ ＴＮＢＳ 法测定了 酶水解 ＷＰ（Ｉ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｅ）的水解度，计算如下：
ｍ（０ ａ０－ ａ）＋ｍ１ａ＋ｍ２ａ＝Ｄｘ 其中：α０ 为底物的初始浓度，α 为每个水解产物 的浓度，ｍ０ 为光密度对底物浓度的直线关系的斜率， ｍ１ 和 ｍ２ 为两种水解产物的斜率。Ｄｘ 任一水解样品的 光密度。 水解度可由下列方程求得： ＤＨ＝κ（Ｄｘ－ ＤＯ） κ等同于 １００（／ α（０ ｍ１＋ｍ２－ ｍ０）），Ｄ０ 初始底物浓度 的光密度。 水合茚三酮与 α－ 氨基酸一起在水溶液中加热， 可发生反应生成蓝紫色物质。首先是氨基酸被氧化分
物的呈色度不同对测定结果造成的误差， 并依据 ＱｉｎＹｕｎ Ｃｈｅｎ［１４］的方法和现行的方法进行改进，使测定 结果更接近真实值。
参考文献：
［１］ Ｄｉ Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｍ．Ｇ． （１９９７）Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｔｈｌｅｔｅ： Ｔｈｅ ａｎａｂｏｌｉｃ ｅｄｇｅ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
一是在研究中需要用其他的方法进行校正；二是这种 成具有荧光性的异吲哚衍生物，其反应如下：
方法仅适用于中性及碱性（ｐＨ＞７）或 ｐＨ＜３ 的酸性溶
液中进行的水解，并且需要特别的仪器控制水解过程
中的 ｐＨ。
袁斌等人［５］在基于国外通用的 ｐＨ－ ｓｔａｔｅ 法基础上，
介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方
１７４ ２００７．Ｖｏｌ．２８．ＮＯ．０７
食品研究与开发
综述
α－ 氨基的解离度可以用下面的公式计算：
１ ａ
＝１＋１０ ｐＫ－ ｐＨ
因为蛋白中亮氨酸游离的氨基的量与碱液的量成
正比关系，斜率用 ｂ 表示，那么分别在 ｐＨ１ 和 ｐＨ２ 下进 行水解，就可以利用下面的公式计算 ｐＫ 值［４］：
ＤＨ＝
ｈｓ－ ｈｔ－
的 ｐＨ，通过加入的用于维持体系 ｐＨ 的碱或酸的量直
接计算出水解度［３］。计算公式如下：
ＤＨ＝
ｈ ｈｔｏｔ
×１００
％＝Ｂ×Ｎｂ
１ ａ
×Ｍ１ｐ
１ ｈｔｏｔ
×１００ ％
Hale Waihona Puke 式 中 ：Ｂ： 是 碱 液 的 体 积 ｍＬ；Ｎｂ 是 碱 液 的 浓 度
ｍｏｌ／ｍＬ；α：是氨基的离解度；Ｍｐ 是底物中蛋白质总含
量 ｇ；ｈｔｏｔ 是底物中蛋白质中肽键的总数 ｍｍｏｌ／ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ）。
ｈｏ ｈｏ
×１００
式中：ｈｓ 和 ｈｏ 分别代表 ＷＰＩ 水解产物中和没进行
水解的 ＷＰＩ 中氨基酸浓度；ｈｔ 代表用 ６ ｍｏｌ／Ｌ 盐酸完全
水解 ＷＰＩ 产物中总的氨基酸的浓度。没有酶的没水解
的蛋白质溶液视为 ０ ％ＤＨ。
ｐＫ＝ｐＨ２＋ｌｏｇ（ｂ２－
ｂ１）－
ｌｏｇ（１０
ｐＨ － ２
ｐＨ１×ｂ２－
根据水解度的定义如果直接用水解后游离氨基总 增加及可溶性蛋白的含量也可以用来表征蛋白质水解
含量计算水解度，由于用水合茚三酮显色法无法判断 的程度。测定水溶性蛋白质的方法很多，有福林 － 酚
水解后的游离氨基是原样品中本来就含有的还是经水 法、双缩脲法、考马斯亮蓝等。
解产生的，因此，赵新淮，冯志彪［１２］对此进行研究，并对
录下所用的碱液的量即可。具体方法如下：水解开始 表每个蛋白分子的肽键总数。ｎ 可用以下公式表示：
时，调节反应体系的 ｐＨ 为 ７．０，反应结束后测定反应 体系的 ｐＨ 值，用 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＯＨ 将反应体系的 ｐＨ
ｎ＝
ΔＡｂｓ×Ｍ×ｄ ε×Ｃ
调到原来的 ｐＨ，记录下所用的碱液的量，按下式即可 计算出酪蛋白的水解度：
肽键数，这里的 ｈ 和 ｈｔｏｔ 单位经常用 ｍｍｏｌ／ｇ 表示。对于 一个特定的蛋白质，ｈｔｏｔ 是一个常数，一般采用文献中 的经验值，比如：大豆蛋白质的 ｈｔｏｔ 值为 ７．８ ｍｍｏｌ／ｇ，酪 蛋白质的 ｈｔｏｔ 值为 ８．２ ｍｍｏｌ／ｇ，也可以根据蛋白质中氨 基酸的组成成分计算得到［２］。
综述
食品研究与开发
２００７．Ｖｏｌ．２８．ＮＯ．０７ １７５
解，放出氨和二氧化碳，氨基酸生成醛，水合茚三酮则 ３．２ 水溶性蛋白质的测定
生成还原型茚三酮。在弱酸性溶液中，还原型茚三酮、
蛋白质通过酶水解，形成易溶解的小分子的多肽
氨和另一分子茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。
溶液，使得溶解性增加，因此在一定程度上，水解度的
１ 水解度的定义
蛋白质的水解度 ＤＨ（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）代表蛋
白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，数学
表达式为：
ＤＨ＝
ｈ ｈｔｏｔ
×１００ ％
式中：ｈ 是被裂解的肽键数，ｈｔｏｔ 是原蛋白质中的总
作者简介：徐英操（１９７８－ ），男（汉），助教，研究方向：食品蛋白质及酶 水解。
在以上的方法中，ｐＨ－ ｓｔａｔ 方法是通过滴定水解过 程中释放的质子测定 ＤＨ，ＯＰＡ、ＴＮＢＳ、水合茚三酮测 定方法及甲醛滴定法都是利用游离氨基发生化学反应 进行测量的，其中用 ＯＰＡ 和 ＴＮＢＳ 测定 ＤＨ 会有很高 的相关性，更精确些，但时间较长。水合茚三酮法测定 的 ＤＨ 一般都很低［１５］。ＯＰＡ 法优于 ＴＮＢＳ，因为更快速 更精确。在用游离氨基显色反应进行测定时，必须要考 虑到，水解后测定的游离氨基含量包括水解释放的游 离氨基和水解前本来就含有的游离氨基。
衍生物具有低荧光性的缺陷，进行研究，建立了通 用、高灵敏度的利用 ＯＰＡ／２－ ＭＥ 进行蛋白质微量氨 基酸分析。
ＴＮＢＳ） 这个方法由 Ｊｅｎｓ Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ［６］于 １９７９ 年进行了
详 细 描 述 ，ＴＮＢＳ 能 与 游 离 的 氨 基 酸 反 应 生 成 能 在
２．４ 水合茚三酮（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）法 早在 １９４９ 年 Ｔｈｅｏｄｏｒｅ Ｂ．Ｓｃｈｗａｒｔ ｚ［１１］就已经对此做
计算如下：ＤＨ＝
１
Ａ ０００×Ｗ
×Ｖ１×１Ｖ０２０
×１００
式中：Ａ：查表得蛋白质的毫克数；Ｗ：称样重（ｇ）； Ｖ１：水解液的总体积（ｍＬ）；Ｖ２：显色时所用稀释液的体 积（ｍＬ）。 ２．５ 甲醛滴定法
［２］ Ａｄｌｅｒ－ Ｎｉｓｓｅｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ［Ｊ］． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８６ａ Ｌｏｎｄｏｎ
白的分子量，ｄ 指稀释因数，ε 指 ３４０ ｎｍ 处的摩尔消 光系数（６ ０００／ｍｏｌ·ｃｍ），Ｃ 指蛋白浓度（ｇ／Ｌ）。
Ｋａｎｇ Ｓ． Ｌｅｅ 等 利 ［１０］ 用荧光法测定游离氨基酸原 理，针对半胱氨酸与胱氨酸与邻苯二醛反应生成的
１／α 为 ２．２６；Ｍｐ：蛋白质的质量（ｇ）；ｈｔｏｔ：每克原料蛋白 质中肽键的毫摩尔数，对于酪蛋白，该值取 ８．２ ｍｍｏｌ／ｇ。 ２．２ 三 硝 基 苯 磺 酸 法 （Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ