遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定

实验四 质粒DNA的提取与鉴定

一、实验目的

1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。

2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。

二、实验原理

质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。

从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。

在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA分开。CccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。电泳后用溴化乙锭染色，在紫外照射下观察和照相记录电泳图谱。

三、材料、仪器和试剂

1、 材料 大肠杆菌菌种

2、 仪器

超净工作台或无菌室，恒温摇床，低温高速离心机，移液器，恒温水浴锅，涡旋振荡器，电泳仪，制冰机，凝胶成像系统等。

3、 试剂

（1）LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast

extract）5g，NaCl 10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.5，用去离子水定容至1升，高压灭菌20min。

（2）LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

（3） 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。

溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100mL，高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。

（4）溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L NaOH母液稀释），1％SDS。

（5）溶液Ⅲ：5mol/L KAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，定容至100mL，并高压灭菌。溶液终浓度为：[K+] 3mol/L，[Ac-] 5mol/L。

（6）饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

（7）氯仿：按氯仿:异戊醇＝24:1的体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

（8）TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

（9）电泳所用试剂：① TBE缓冲液（5×）：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M

EDTA（pH8.0）20mL，定溶至1000mL。② 上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。

四、操作步骤

1、大肠杆菌的培养和质粒的扩增

2、质粒DNA的提取

（1） 取1-5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000

rpm(~13,400×g ) 离心1 分钟，尽量吸除上清（若菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

（2）向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl 溶液1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

（3）向离心管中加入250 μl 溶液2，温和地上下翻转6－8 次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA，造成提取的质粒中混有基因组 DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过 5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应适当减少菌体量。

（4）向离心管中加入350 μl 溶液3，立即温和地上下翻转6–8 次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心10 分钟，此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

注意：溶液3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

（5）可选步骤：向吸附柱中加入500 μl 去蛋白液W1，12,000 rpm (~13,400×g )离心30–60

秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM 系列， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 此步聚可能会影响质粒的得率，如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。

（6）向吸附柱中加入700 μl 漂洗液W2 （请检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm

( ~13,400×g )离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管

中。

（7）向吸附柱中加入500 μl 漂洗液W2，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 秒，

倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

（8）将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 分钟，目的是将吸附

柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（9）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60-100 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g) 离心1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。

注意： 洗脱液的 pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其 pH值7.0-8.5范围内(可以用 NaOH将水的 pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于 60 μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防 DNA降解。

3、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 注意事项

1． 按1：100 的比例向溶液1 中加入RNaseA，混匀，置于2–8℃保存。

2． 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液W2 中加入无水乙醇。

3． 使用前请先检查溶液2 和溶液3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水

浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

4． 注意不要直接接触溶液2 和溶液3，使用后应立即盖紧盖子。

5． 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm

(~13,400×g )。

6． 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

7． 去蛋白液W1 可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、

HB101、ET12567、JM 系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去

蛋白液W1。

8． 去蛋白液W1 可能会影响实验得率，因此如果宿主菌非上述提及的名称，可省略此步骤。

思考题

1. 在质粒提取过程中，SDS、氯仿-异戊醇、苯酚的作用各是什么？

2. 细菌的收获和质粒DNA提取过程中应注意的事项？