下载文档原格式
棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定邵红莲;赵小凡;董杜鹃;扈进冬;邵丁丁;杨晓梅;王金星【期刊名称】《山东大学学报：理学版》【年(卷),期】2005(40)6【摘要】以棉铃虫(helicoverpa armigera)组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bad、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4 d 的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测.结果:感染上清中的芽生病毒的DNA 作模板扩增出预期的1 700bp片段,SDS-PAGE、Western-blotting检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性.【总页数】6页(P107-111)【关键词】棉铃虫;组织蛋白酶B;杆状病毒-昆虫细胞表达系统;转染;基因重组表达【作者】邵红莲;赵小凡;董杜鹃;扈进冬;邵丁丁;杨晓梅;王金星【作者单位】山东大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.鸭坦布苏病毒E蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定 [J], 王善辉2.两个棉铃虫酯酶基因(001f和001g)在杆状病毒表达载体系统(BEVS)中的表达及酶活分析 [J], 李永强;袁国瑞;张兴3.猪圆环病毒2型CAP蛋白在flashBAC杆状病毒表达系统中的表达与鉴定 [J], 郭慧娟;樊翠;张英;吕茂杰;梁武;杨保收4.人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定 [J], 熊强; 姜晓燕; 丁立新; 刘晓丹; 周平坤; 丁库克5.重组牛IFN-γ蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化和鉴定 [J], 王睿男;孙雨;蒋菲;刘亚涛;宋晓晖;刘永生;王文;储岳峰;曹小安;王传彬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
棉铃虫信息素结合蛋白2 cDNA的克隆、表达与组织特异性表达张帅;张永军;苏宏华;高希武;郭予元【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2009(042)007【摘要】[目的]克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白.[方法]以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT-PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1 表达载体在BL21(DE3)系统中进行原核表达,使用GSTrap FF预装柱进行纯化并切去标签.[结果]克隆了命名为HarmPBP2(GenBank 登录号:EU647241)的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457 bp,编码149个氨基酸残基,前端是一段25个氨基酸长的信号肤,推测蛋白具有昆虫信息素结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征.棉铃虫HarmPBP2在雌雄成虫的触角、足和翅中都有表达,另外在雌虫下颚须也有表达.雌雄组织表达量顺序相同,触角中表达量最高,翅中次之,足中最少.雌虫组织中表达量高于雄虫.构建的原核表达载体pGEX/HarmPBP2,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出一个分子量约为40 kD 的融合蛋白,经亲和层析纯化与酶切得到去标签的HarmPBP2蛋白.[结论]克隆、分析和表达了棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA序列,并对其进行纯化,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础,同时对其表达谱进行了研究.【总页数】7页(P2359-2365)【作者】张帅;张永军;苏宏华;高希武;郭予元【作者单位】中国农业科学研究院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100193;中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100193;中国农业科学研究院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学研究院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100193;中国农业大学农学与生物技术学院,北京,100193;中国农业科学研究院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S4【相关文献】1.鸭Rab6基因cDNA的克隆及组织特异性表达 [J], 龚道清;董飚;孟和;顾志良2.棉铃虫Gq蛋白α亚基基因的克隆及组织特异性表达 [J], 苏宏华;王桂荣;吴孔明;郭予元3.冈比亚按蚊嗅觉结合蛋白基因agCP1588的克隆鉴定及其组织特异性表达谱分析 [J], 李正西;Jing-Jiang ZHOU4.棉铃虫嗅觉受体基因的克隆及组织特异性表达 [J], 王桂荣;吴孔明;苏宏华;郭予元5.甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及组织特异性表达分析 [J], 张红岩;薛华;马欣荣;赵云;王茂林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
粘虫颗粒体病毒的增效因子提高杆状病毒的感染丁翠;邓塔【期刊名称】《昆虫学报》【年(卷),期】1995(038)004【摘要】一株美洲粘虫ＧＶ（增效品系）在东方粘虫幼虫上进行增殖，所获粘虫ＧＶ（ＰｕＧＶ－Ｐｓ）对东方粘虫ＮＰＶ（ＰｓＮＰＶ）、棉铃虫ＮＰＶ（ＨａＮＰＶ）和黄地老虎ＮＰＶ（ＡｓＮＰＶ）进行增效试验。
实验结果证明ＰｕＧＶ－Ｐｓ对三种ＮＰＶ都有明显的增效作用，其中以对ＰＳＮＰＶ为最强，增效率达５５％－８５％对ＨａＮＰＶ为３０％－８０％；而对ＡｓＮＰＶ只有１５％－３５％。
用凝胶过滤技术从ＰＳＧＶ－Ｐｓ中分离增效因子ＰｕＳＦ－Ｐｓ，其对ＰｓＮＰＶ和ＡｓＮＰｙ的增效作用亦同样明显，２５０μｇ的ＰｕＳＦ－Ｐｓ可以提高ＰｓＮＰＶ的感染能力达８０％。
经Ｓｅｐｈａｄｅｒ－１５０柱（１．６×９０）和使用四种标准蛋白（细胞色素Ｃ、胃蛋白酶、牛血清清蛋白和乳酸脱氢酶）测得ＰＳＳＦ－Ｐｓ的分子量为１６００００左右。
【总页数】7页(P407-413)【作者】丁翠;邓塔【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】S476.13【相关文献】1.转宿主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因的克隆表达及活性 [J], 徐健;赵松;刘琴;杨青;李传明2.转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性 [J], 徐健;赵松;刘琴;杨青;李传明;3.粘虫颗粒体病毒增效因子的基因定位 [J], 刘强;白小东;丁翠;叶寅4.粘虫颗粒体病毒增效因子的分离纯化及其生化性质 [J], 刘强;丁翠;蔡秀玉5.粘虫颗粒体病毒及其增效因子对粘虫核型多角体病毒的增效作用 [J], 刘强;丁翠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
２期李杰等：棉铃虫中肠ｅＤＮＡ表达文库的免疫筛选及其克隆分析２ｌ－‘Ｔ●●－ＲＩＣＵＬＴＵＲＡＥＩＩＩＩｌｉｅＩＩＬＪ－ＳＩＨＩ％图１棉铃虫围食膜粘蛋白结构域分析Ｆｉｇ．１ＤｉａｇｒａｍｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｄｏｍａｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＨ．ａｒｍｌｇｅｒａｉｎｔｅｓｓｔｉｍａｌｍｕｃｉｎｓ２．４棉铃虫围食膜糖蛋白的检测的区域。
在生物合成中，脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸是对棉铃虫围食膜进行糖蛋白检测，经ＰＡＳ染色Ｏ一糖基化的连接位点一１。
与其相似，昆虫围食膜肠后大部分棉铃虫围食膜蛋白被染成洋红色。
如图２粘蛋白与哺乳动物的粘蛋白也有很多一致的功能，所示，棉铃虫围食膜糖蛋白约占围食膜总蛋白的例如，润滑经过中肠的食物通道，阻止病菌侵染，以７５％，这与文库筛选结果一致。
及减少消化蛋白酶对上皮细胞的影响等。
棉铃虫粘蛋白与已知的昆虫肠粘蛋白相比，它们均为富含脯氨酸，苏氨酸，丝氨酸的糖蛋白，由若干个ＣＢＤｓ构成，中间镶嵌着高度糖基化的ＭＤ，这是昆虫粘蛋白的共有特征，如图３所示。
而Ｏ一联糖基化和半胱氨酸富集结构域的空间结构差异很大，Ⅳ．联糖基化位点的分布并不均匀，可在任何位点出现。
１．ＰＡｂ染色；２．银染。
在已经发现的鳞翅目昆虫围食膜粘蛋白中，甜１·ＰＡＳａｔａｉｎｉｎｇ；２·Ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ·菜夜蛾肠粘蛋白ＳｅｌＩＭ．８除具有已知昆虫肠粘蛋白图２棉铃虫围食膜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱的氨基酸序列特征外，还含有一个独特的天冬氨酸Ｆｉｇ·２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ富集区…］。
该区域内序列ＤＤＤＫＰＧＣＮＧＮＣＰＥ重复口ｒｍｌｇｅｒａｐｅｒｉｔｒｏｐ埘。
ｍ蛐ｂｒ蛐。
达１２次，酸性氨基酸天冬氨酸含量为２４％，这是首２；瓢次在昆虫蛋白中报道，其在围食膜蛋白结构中的作，－４－用尚未可知。
在棉铃虫ＩＩＭ８６中也发现具有天冬氨本研究通过从文库筛选得到的ｃＤＮＡ中随机挑酸．甘氨酸富集区，是否与甜菜夜蛾的天冬氨酸富集选２６个进行测序及分析，其中有１９个编码肠粘蛋区有相似功能尚待进一步研究。
大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。
大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。
本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。
大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。
表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。
启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。
参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。
大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。
2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。
3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。
4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。
5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。
大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。
2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。
3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。
4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。
总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。
棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达常团结;陈蕾;路子显;陈宛新;孟昆;朱祯【期刊名称】《动物学报（英文版）》【年(卷),期】2002(048)006【摘要】根据昆虫类胰蛋白酶序列的保守性设计了一对引物,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫中肠总RNA反转录出cDNA第一链作为模板,利用RT-PCR,分离出了一种棉铃虫类胰蛋白酶(HaT)基因的cDNA序列.分析表明该cDNA序列的开放阅读框为696 bp,编码一个由231个氨基酸残基组成的多肽,推测的氨基酸序列具有His57、Asp102、Ser192组成的电荷中继网,决定胰蛋白酶底物专一性的Asp189,底物结合部位的Gly216和Gly226残基,及其它胰蛋白酶结构上的保守区域.氨基酸序列同源性比较表明:HaT同其它鳞翅目昆虫类胰蛋白酶有较高的同源性,同源性在44%～79%之间.为研究棉铃虫类胰蛋白酶基因(hat)编码产物的活性,将其插入原核表达载体pGEX4T-3和pET23b中,并在大肠杆菌中进行了诱导表达,结果表明,GST-HaT融合蛋白在大肠杆菌中进行了特异表达,非融合形式的表达产物HaT具有胰蛋白酶催化活性.【总页数】7页(P790-796)【作者】常团结;陈蕾;路子显;陈宛新;孟昆;朱祯【作者单位】中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101【正文语种】中文【中图分类】Q96因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
组织蛋白酶B在棉铃虫个体发育过程中的表达及活性研究杨晓梅;侯立静;董杜鹃;王金星;赵小凡
【期刊名称】《山东大学学报：理学版》
【年(卷),期】2005(40)5
【摘要】运用原位水解电泳、免疫印迹和免疫组织化学等方法系统研究了组织蛋白酶B(HCB)在棉铃虫个体发育过程中的表达及活性变化规律.研究显示,HCB的表达和活性随着胚胎发育的进行逐渐下降;整个幼虫阶段都没有HCB的表达和活性;整个蛹和成虫阶段虽然都有HCB的表达,但HCB的活性只能在发育晚期的蛹和成虫组织中检测到.这些现象表明,HCB的表达和活化属于翻译后控制,同时与棉铃虫的个体发育和组织分化有着密切的关系.
【总页数】6页(P119-124)
【关键词】组织蛋白酶B;棉铃虫;个体发育;酶活性
【作者】杨晓梅;侯立静;董杜鹃;王金星;赵小凡
【作者单位】山东大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q556.9
【相关文献】
1.泥蚶(Tegillarca granosa)个体发育过程中同工酶基因表达与调控的研究 [J], 苏秀榕;吕振明;李太武;林志华;柴雪良
2.白鲢个体发育过程中同工酶基因的表达与调控研究 [J], 吴力钊;王祖熊
3.棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 杜欣军;邵红莲;邵丁丁;赵小凡;王金星
4.棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达 [J], 董杜鹃;扈进冬;张新昌;李子劲;王金星;赵小凡
5.棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定 [J], 邵红莲;赵小凡;董杜鹃;扈进冬;邵丁丁;杨晓梅;王金星
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化杜欣军;邵红莲;邵丁丁;赵小凡;王金星【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2004(012)002【摘要】用合成的基因特异性引物通过RT-PCR扩增,获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)组织蛋白酶B基因(HCB),将基因克隆到pGEX-4T-1载体,在大肠杆菌(Escherichia coii)DH5α内进行扩增,经过PCR筛选获得阳性克隆并提取质粒和测序验证后,再转化大肠杆菌BL21进行诱导表达.表达产物为组织蛋白酶B-谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白,分子量在63 kD左右.表达产物形成了包涵体,经过对包涵体变性和复性处理,得到了可溶性的融合蛋白,可被Glutathione Sepharose 4B柱亲和纯化,用凝血酶裂解融合蛋白后,经SDS-PAGE分离到37 kD左右的棉铃虫组织蛋白酶B酶原.N-末端氨基酸测序鉴定表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B.【总页数】5页(P162-166)【作者】杜欣军;邵红莲;邵丁丁;赵小凡;王金星【作者单位】山东大学生命科学院生化与分子生物学研究所,济南,250100;山东大学生命科学院生化与分子生物学研究所,济南,250100;山东大学生命科学院生化与分子生物学研究所,济南,250100;山东大学生命科学院生化与分子生物学研究所,济南,250100;山东大学生命科学院生化与分子生物学研究所,济南,250100【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.从大豆中纯化棉铃虫组织蛋白酶B抑制因子HCB-SoyI [J], 张新昌;刘杨;王金星;赵小凡2.炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 展德文;刘向昕;陶好霞;王令春;张兆山3.棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达 [J], 董杜鹃;扈进冬;张新昌;李子劲;王金星;赵小凡4.棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定 [J], 邵红莲;赵小凡;董杜鹃;扈进冬;邵丁丁;杨晓梅;王金星5.组织蛋白酶B在棉铃虫个体发育过程中的表达及活性研究 [J], 杨晓梅;侯立静;董杜鹃;王金星;赵小凡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
![棉铃虫增效蛋白基因工程菌株的构建及其增效蛋白的表达[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/d6ef7eed79563c1ec4da713e.png)
专利名称：棉铃虫增效蛋白基因工程菌株的构建及其增效蛋白的表达
专利类型：发明专利
发明人：孟小林,徐进平
申请号：CN01114675.3
申请日：20010509
公开号：CN1384189A
公开日：
20021211
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种通过基因工程方法构建获得工程菌株:CCTCC NO:M201010 Escherichia coli M15(pEHa)工程菌株的构建方法和工程菌株的用途。
该菌株是以棉铃虫颗粒体病毒(HaGV)DNA为模板,通过PCR扩增产生HaGV增效蛋白基因,再经酶切,酶连接构建含HaGV增效蛋白基因的重组载体pQEHa,转化E.coli M15(pREP4)而获得。
该工程菌株所携带的重组载体pQEHa,含HaGV增效蛋白基因,并能够高效表达HaGV增效蛋白。
图1为本发明含HaGV增效蛋白基因的重组表达质粒pEHa示意图。
申请人：深圳万德福基因工程有限公司
地址：518031 广东省深圳市上步南路锦峰大厦21D
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。
棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达胡蓉;孟小林;徐进平;王健;鲁伟【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2001(016)004【摘要】以棉铃虫颗粒体病毒(Helicoverpa armigera granulosis virus,简称HaGV)基因组的DNA为模板设计引物,PCR扩增病毒增效蛋白(Enhanicn)基因,然后经BamHI/Pst I双酶切消化,得到近乎全长的约2.6kb的增效蛋白基因片段,再与pQE32质粒连接,构建了重组表达载体pQE2/En,转化大肠杆菌M15(pREP4),在IPTG诱导下表达出分子量约为102kD的融合蛋白并命名为P102,纯化的P102包涵体显示了明显的增效活性,在感染后168h时统计可提高HaNPV对棉铃虫幼虫的感染死亡率6.25%～27.09%,缩短LT5012.3h以上;在感染后72h时统计可提高Bt对棉铃虫幼虫的感染死亡率28.18%,缩短LT5o12.33h.【总页数】5页(P364-368)【作者】胡蓉;孟小林;徐进平;王健;鲁伟【作者单位】武汉大学病毒研究所,;武汉大学病毒研究所,;武汉大学病毒研究所,;武汉大学病毒研究所,;武汉大学病毒研究所,【正文语种】中文【中图分类】S435.6623【相关文献】1.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达 [J], 欧洋;孟小林;徐进平2.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5'端截短片段的表达及增效活性测定 [J], 刘相国;杨恭;邱并生;张克勤;田波3.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因克隆及在大肠杆菌中表达 [J], 刘相国;杨恭;邱并生;田波4.乳糖作为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达诱导剂的可行性研究 [J], 董琳茜;张克勤;邱并生5.转宿主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因的克隆表达及活性 [J], 徐健;赵松;刘琴;杨青;李传明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乳糖作为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达诱导剂的可行性研究董琳茜;张克勤;邱并生
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】2003(030)006
【摘要】乳糖不仅可以诱导棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达,而且表达量与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂时相比,并不低于后者,这样大规模生产棉龄虫颗粒体病毒增效蛋白的成本就可能被降低.乳糖的最适浓度经优化为
2.2%～2.5%(W/V).对乳糖的不同除菌处理表明:0.70×105Pa 15min蒸汽灭菌的乳糖可以诱导此增效蛋白表达,这种处理比滤膜过滤除菌更为方便和经济,因此就为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白的生产提供了经济实用的前景.
【总页数】5页(P5-9)
【作者】董琳茜;张克勤;邱并生
【作者单位】云南大学生物资源保护与利用重点实验室,昆明,650091;云南大学生物资源保护与利用重点实验室,昆明,650091;中国科学院微生物研究所分子病毒学开放实验室,北京,100080
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
【相关文献】
1.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因
2.6kb片段的表达 [J], 胡蓉;孟小林;徐进平;王健;鲁伟
2.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达 [J], 欧洋;孟小林;徐进平
3.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5'端截短片段的表达及增效活性测定 [J], 刘相国;杨恭;邱并生;张克勤;田波
4.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因克隆及在大肠杆菌中表达 [J], 刘相国;杨恭;邱并生;田波
5.乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响 [J], 李春丽;席燕燕;陈正华;何国庆
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5'端截短片段的表达及增效活性测定刘相国;杨恭;邱并生;张克勤;田波【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2001(041)002【摘要】将带有棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白(HaGV enhancin)基因的重组表达载体pET-30a-En分别用Bal Ⅰ和Dra Ⅰ酶切后连接,构建重组表达载体pET-30a-Ben和pET-30a-Den,其外源基因的开放阅读框分别为HaGV增效蛋白基因5'端的1.7kb和2.2kb.IPTG诱导表达产生66.7kD和85.1kD的多肽并命名为Ben和Den.初步纯化的Ben和Den显示了对棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)及Bt的增效活性.Ben可对棉铃虫核多角体病毒增效10.5%～26.5%,LT50缩短0.9d,Den增效10.2%～33.0%,LT50缩短1.2d～1.9d.重组增效蛋白可对Bt(1:2500稀释)增效20.7%～35.4%,Den增效16.7%～31.5%,Ben增效¨.7%～27.4%.这为进一步研制抗虫工程菌打下了良好的基础.【总页数】6页(P167-172)【作者】刘相国;杨恭;邱并生;张克勤;田波【作者单位】中国科学院微生物研究所分子病毒学和生物工程开放实验室,北京,100080;中国科学院微生物研究所分子病毒学和生物工程开放实验室,北京,100080;中国科学院微生物研究所分子病毒学和生物工程开放实验室,北京,100080;云南大学工业微生物重点实验室,昆明,650091;中国科学院微生物研究所分子病毒学和生物工程开放实验室,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】S432.4【相关文献】1.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达 [J], 胡蓉;孟小林;徐进平;王健;鲁伟2.棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达 [J], 欧洋;孟小林;徐进平3.转宿主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因的克隆表达及活性 [J], 徐健;赵松;刘琴;杨青;李传明4.转宿主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因的克隆表达及活性 [J], 徐健;赵松;刘琴;杨青;李传明;5.粉纹夜蛾颗粒体病毒增效因子C-末端片段的克隆表达及其生物活性初步测定 [J], 刘平;孟小林;徐进平;姜小文;叶林柏;郜金荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组增效蛋白对Bt和氯氰菊酯防治棉铃虫的增效作用
袁哲明;陈浩涛;梁晨彩
【期刊名称】《中国生物防治学报》
【年(卷),期】2006(022)003
【摘要】前期在大肠杆菌中表达得到具有显著生物活性的含粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C端818个氨基酸的融合蛋白P96.以毒饲料法研究P96对苏云金芽孢杆菌和氯氰菊酯杀棉铃虫敏感、抗性品系的增效作用.结果表明:P96对Bt杀棉铃虫敏感、低抗、中抗品系的增效比分别为3.34、4.72和9.82;对氯氰菊酯杀棉铃虫敏感、低抗、中抗品系的增效比分别为2.53、3.38和6.24. 随棉铃虫抗性升高,P96的增效作用愈为明显. 单对汰选是快速选育棉铃虫抗Bt品系的有效方法.
【总页数】4页(P194-197)
【作者】袁哲明;陈浩涛;梁晨彩
【作者单位】湖南农业大学生物安全科技学院,长沙,410128;湖南农业大学生物安全科技学院,长沙,410128;湖南农业大学生物安全科技学院,长沙,410128
【正文语种】中文
【中图分类】S482.398
【相关文献】
1.重组增效蛋白对棉铃虫的弱化作用 [J], 陈浩涛;潘雪义;袁哲明;谭济才
2.化学添加剂对Bt防治棉铃虫的增效作用 [J], 王明道;杨成运;吴云汉;高玉千;戚元成;贾新成
3.AO-318农药增效剂在棉铃虫防治中的增效作用 [J], 张春芬;郑永利;姚登记
4.无机盐对Bt制剂防治棉铃虫的增效作用研究 [J], 王明道;尹新明;郭线茹;吴云汉;贾新成
5.Bt杀虫蛋白对棉铃虫的抗虫毒力和增效作用 [J], 范贤林;赵建周;芮昌辉;谢天健因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌...朱国凯;屠益增【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】1992(008)001【摘要】用携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc360-β-gal 与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经X-gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV-β-gal。
该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物——β-半乳糖苷酶。
80%以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β-半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白——大肠杆菌β-半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。
【总页数】6页(P34-39)【作者】朱国凯;屠益增【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】Q81【相关文献】1.利用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达人胰激肽释放酶 [J], 黄瑞芳;杜珙;李体远;陈德珩;戴勇;朱莹2.利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-1的研究 [J],3.利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子 [J], 王雅梅;孙丽翠;闫豫东;司杨;张静宜;祁雅慧4.利用杆状病毒载体高效表达人胰岛素样生长因子-1及其纯化的研究 [J], 段宇;汪承亚;赵红;陈家伟5.利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-2(hIGF-2) [J], 段宇;汪承亚;赵红;张志芳;陈家伟;John S Sussenbach因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!/-01-2$%%%收稿日期：!&&&3!$3!#，修回日期：$%%%3%"3!#。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（4%%46）。
棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因!"#$%片段在大肠杆菌中的表达欧洋孟小林"徐进平（武汉大学病毒研究所武汉64%%5$）摘要以棉铃虫颗粒体病毒（3%,#0(4%*5++*6#1%*+7289:)(;<;=<2:;，简称>8?’）基因组@+A 为模板，设计引物B C D 扩增病毒增效蛋白（E 9F 89G <9）基因，然后经7+0H ／8&/H 双酶切消化，得到#I 端截短的约$J !K 1增效蛋白基因片段，再与.L E 4%质粒连接，构建了重组表达载体.L E ／E 9C ，转化大肠杆菌M !#（.D E B 6），在H B N ?诱导下表达出分子量约为5O P !%4@的融合蛋白并命名为B 5O ，纯化的B 5O 包涵体显示了明显的增效活性，可提高A G M +B ’对小菜蛾幼虫的感染率$5J O O Q !4$J &$Q 。
关键词棉铃虫颗粒体病毒，增效蛋白基因，克隆，表达，生物活性测定中图分类号L 5O文献标识码A文章编号!%%%34%"!3（$%%%）%#3%#%6昆虫杆状病毒增效蛋白（E 9F 89G <9）也称病毒增效因子（’<28)-9F 89G <97R 8G /(2，’E S ），是由某些杆状病毒基因编码具有促进核型多角体病毒感染的一类金属蛋白酶［!］，具酯酶活性［$］，而且能够提高苏云金杆菌伴孢晶体对幼虫的毒力［4］。
自N 898T 8!&#&从美洲一星粘虫（8&%)9+,%/#+)$#5)$0/+，B :）?’中分离出增效蛋白［6］，随后在粉纹夜蛾（:*#;0"(5,)&#+$#）?’、棉铃虫?’、小菜粉蝶（8#%*#&*+;5+%）?’、旋幽夜蛾（70(/(1*+66+/*#-(,##）?’和舞毒蛾（<26+$/*#+9#&5+*）+B ’以及东方粘虫（8&%)9+,%/#+&%5+*+/+）痘病毒（E 9/(0(.(U =<2:;，E B ’）［#!O ］中发现了增效蛋白的存在。
迄今关于增效蛋白协同杀虫的作用方式，有两种观点，一是增效蛋白具有蛋白酶活性，能够降解宿主中肠围食膜的肠粘蛋白和糖蛋白，破坏了靶昆虫抵御病原微生物的第一道防线，使病毒粒子更易进入中肠细胞；二是介导病毒囊膜与中肠细胞质膜的融合。
目前的研究结果表明增效蛋白主要以第一种方式协同杀虫［&］。
>8?’增效蛋白基因的V D S 大小为$5%"1.，编码含&%$个氨基酸，分子量为!%6J "K @的蛋白质。
我们构建了>8?’-9F 89G <9基因不同片段大小的一系列表达载体，旨在探讨增效蛋白基因结构与功能的关系。
本文报道了该基因4I 端$J !K 1的片段在大肠杆菌中的克隆与表达，并对表达产物的增效活性作了初步研究。
该项工作对于我国在生物防治农林害虫的研究领域有着积极的理论及应用价值。
#材料与方法#"#实验材料棉铃虫颗粒体病毒>8?’由美国汤姆・杰弗逊大学微生物学及免疫学系W 8<)<9X :博士赠送，质粒.L E 34%、大肠杆菌M !#（.D E B 6）购自L H A ?E +公司，限制酶、N 6@+A 连接酶等购自华美生物技术公司，小菜蛾幼虫由武汉大学Y /研究室提供。
#"!实验方法#"!"#>8?’Z @+A 的提取：参照文献［!%］的方法进行。
#"!"!>8?’3-9F 89G <9基因的B C D 扩增：据已发表>8?’3-9F 89G <9基因序列［"］，设计引物为：（!）#N ?A A N ?N N C ?N N N ?CN C N C ?C ?N N ?N N（上游引物），（$）#A N A C N ?C A ?N ?N N C N C C C A C N A C N A A N （下游引物，含有8&/H 酶切位点）引物由上海生工公司合成。
>8?’3@+A 模板&6[预变性#0<9，B C D 循环参数：&6[、"%;，#"[、&%;，5$J #[、!O %;，循环4%次，最后5$J #[延伸50<9。
经电泳检测，得到单一的长约$J 5K 1的!"#$%&’("’)*’基因片段。
!"#"$重组表达质粒+,-／-’.的构建：利用!"#$%&’("’)*’/&’&内部有!"#0单一酶切位点，用!"#0／$%&0双酶切质粒+,-%12和3.4产物，3.4产物经!"#0／$%&0双酶切，产生25678（!"#$%&’% ("’)*’/&’&9:端片段）和;5<78（!"#$%&’("’)*’/&’&1:端片段）的两个片段，25=>低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收;5<78的片段和双酶切消化的质粒片段。
用?@A B C连接酶于<6D水浴连接@(，转化感受态细胞’(#)*+E<9（+4-3@），经C F+)*G G*’和H"’"F I)*’双抗平板筛选得到阳性转化子。
此构建的重组质粒命名为+,-／-’.。
!"#"%+,-／-’.的酶切鉴定：重组质粒A B C分别经$%&0，!"#0单酶切，,"-!0／.+/J!，01/0／.+/J!双酶切，25=>琼脂糖电泳照相。
!"#"&-’("’)*’/&’&1:端;5<78片段的表达：挑取重组子单菌落接种于9F KK L培养基中（C F+% )*G G*’<22"/／F K和H"’"F I)*’;9"/／F K，下同）活化过夜。
活化菌液以<M;2稀释接种到<2F KK L 中，1@D培养1(，加03?#至终浓度<F F N G／K，1=D诱导9(，取诱导9(和未诱导培养物各<F K，收集菌体进行O A O%3C#-。
!"#"’表达产物的初步纯化：离心收集诱导后菌体，加裂解液（92F F N G／K?P*Q%!.G+!R S2，2S< F N G／KB".G，溶菌酶;F/／/菌体蛋白），溶菌酶1=D<(，冰浴超声波破碎<2F*’，处理物上蔗糖梯度12>#62>，@222（P／F*’）T@2F*’，取出白色包涵体带，洗糖1次，将包涵体样品稀释后于透射电镜下观察并照相，剩余样品@D保存备用。
!"#"(生物测定：将C)B3$和纯化的包涵体表达产物（命名为3=R）作<2倍稀释并用血球记数板记数。
设（<）B3$：即C)B3$;5@1T<2630L／F K （+N G I(&J P"*’)G U Q*N’8N J I，多角体）；（;）B3$V <21W L：即C)B3$;5@1T<2630LV3=R<5;T<21 W L／F K（N))G U Q*N’8N J I，包涵体）；（1）B3$V <2@W L：即C)B3$;5@1T<2630LV3=R<5;T<2@ W L／F K；（@）B3$V8")X&P*"G+P N X&*’，即C)B3$ ;5@1T<2630L／F K V未诱导菌体蛋白<"/；（9）健康幼虫对照，仅喂食新鲜菜叶。
将小菜蛾;#1龄幼虫单虫饲养于;@孔.N Q X"P!Y细胞培养皿中，将上述（<）、（;）、（1）、（@）分别制备处理液922"K，涂抹于洗净的新鲜菜叶表面，待菜叶晾干，把菜叶剪成大小一致的若干小叶片，放置于每孔细胞皿中，幼虫取食#实验结果#"!重组表达质粒)*+／+,-的构建与酶切鉴定重组表达质粒+,-／-’.的构建过程如图<。
根据已报道的!"#$增效基因序列及+,-Z-’.的构建过程。
+,-／-’.经$%&0单酶切，应得95978的片段，宿主菌自身携带有质粒+4-3@（15=78），+4-3@上具有$%&0的两个识别位点，经$%&0单酶切，得;5R78和25[78片段；+,-／-’.经,"-!0／.+/J!双酶切，得15@78和;5<78的片段，+4-3@具有.+/J!单一酶切位点，无,"-!0酶切位点，经.+/J!单酶切，得15=78的片段；+,-／-’.经01/0／.+/J!双酶切，应得@5678和25[78的片段，+4-3@上无01/0酶切位点，有.+/J!单一酶切位点；凝胶电泳结果与预期相符。
结果如图;。
卷!"!增效基因的表达及表达产物的纯化表达产物的!"#$%$&’()*如图+。
结果表明，含重组质粒的!"#$%&,!-菌表达了含增效蛋白.&端/"0个氨基酸，共/0"个氨基酸的融合蛋白。
根据氨基酸序列推算的融合蛋白分子量为/12!/3!"+%（命名为’/1），$%$&’()*结果显示融合蛋白的分子量约为/14%，电泳结果与预计的相符。
")*$%""&T’U（!"N）T’U（!"N）SR M（!"+）T’U（!"N）SR M（!"K）T’U（!"N）S M;C F B A9;<5A?F B97（!%:）[;F B A C?7F A?<T I D E B A?@<;A\;B F A B;F B G+++W+"+N+N .?A A B C FD?A F;<9F=?7F Q B!!F QG;=5?>F&97@B C F9?7／#-"2+"1+200/12!1-!21/12++基因的(C,T’U重组病毒株，他们的研究发现当*7Q;7C97:B7B在(C,T’U中大量表达时，重组病毒多角体产量大为降低，形态上也比野生型病毒多角体小得多，*7Q;7C97:B7B的表达干扰了多角体的正常形成。
