酵母双杂交系统技术介绍

膜系统酵母双杂交原理酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。

双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。

细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。

80 年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modula r），即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA 结合结构域（DNA binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain ，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。

单独的DB 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。

而不同转录激活因子的DB 和AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。

如酵母细胞的Gal4 蛋白的DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。

Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。

他们以与调控SUC2 基因有关的两个蛋白质Snf1 和Snf2 为模型，将前者与Gal4 的DB 结构域融合，另外一个与Gal4 的AD 结构域的酸性区域融合。

由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“ 诱饵” （bait）和“ 猎物” 或靶蛋白（prey or target protein）。

如果在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。

酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。

而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。

酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。

前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。

Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。

将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。

当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。

特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。

酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。

酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。

本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。

二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。

转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。

这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。

在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。

如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。

通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。

三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。

设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。

2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。

酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。

它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。

具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。

酵母双杂交原理酵母双杂交（Y2H）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术。

它基于酵母细胞内所含的转录因子结合区域分开的与激活区域结合的能力的原理而发展出来。

当把转录因子分成两个区域，一个称为DBD（DNA binding domain），另一个称为AD（activation domain），并使它们相互独立地与相应的配体结合时，它们就可以进行有效的转录激活。

通常来说，DBD和AD都不具有激活作用，但它们可以相互结合并发挥起激活作用。

因此，当DBD与某一DNA序列结合时，如果另一配体结合于AD，则该复合体就可以被转录激活。

基于这个原理，Y2H技术使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为实验系统进行实验。

它使用了两个重要的质粒：一个称为“鱼钩”质粒（bait plasmid），它含有DBD和一个感兴趣的基因的DNA序列；另一个称为“猎物”质粒（prey plasmid），它含有AD和另一感兴趣的基因的DNA序列。

这两个质粒分别要被转化到两个不同的酿酒酵母分别作为它们的基因组。

当两个酵母的基因组都被转化后，它们被分别引入到含有选择性培养基的平板中去。

在这些平板上，只有那些同时表达了成功酯化的双杂交融合DBD和AD的细胞才能成长起来。

因此，这个实验系统几乎可以保证筛选到高亲合力的蛋白质因子。

值得注意的是，由于酿酒酵母是真核生物，与含有DBD和AD的两个质粒的匹配也是在真核生物级别上完成的，而不是简单的受体和配体之间的作用。

因此，这种技术可以很好地模拟在真核生物细胞内发生的相互作用。

Y2H技术不仅可以用于蛋白质因子的筛选，也可以用于检测DNA的相互作用。

例如，在要求蛋白质－DNA相互作用的特定细胞系上建立的实验系统中，可以使用这种技术来筛选那些与基因诱导子结合的转录因子。

因此，该技术可用于分析人类疾病中蛋白质相互作用的发生机制。

总的来说，酵母双杂交技术是一种强大而有效的分子生物学工具，可以用于研究蛋白质之间的相互作用以及转录机制。