新农药创制_一切从零开始_李禾

大 公 司所 拥 有 ， 先 正 达 、 耳 、 氏 、 邦 、 如 拜 陶 杜 巴斯
夫 ５家跨 国农 药企 业 在 中 国获 得 登 记 的农 药 产 品
就有 ７ ４个 之 多 。
术 、 产 品 ， 眼 国 际前 沿 ， 同组 织 技 术 攻 关 ， 新 着 共 积 极 实施 科 技 项 目， 速科 技 成 果 转 化 ， 占技 术 制 加 抢 高点 ， 能成 为 中国农 药行 业 科 技创 新 的领 跑 者 。其
新 发展 重 任 。要 积 极 与著 名 高校 、 研 院 所 紧密 合 科 作 ，建 立 起 以大 型 骨 干 企 业 集 团 为 主 体 的技 术 创 新 联盟 ， 引 国 内行业 顶级 专 家 、 授 和 技 术 权 威 吸 教
参 与 ， 学 研 相 结 合 ， 合 行 业 科 技 资 源 ， 进 新 产 整 促 药 的研 发 与应 用 ， 围绕 农 药 产 业 的 新 工 艺 、新 技
新 ， 断满 足消 费 者 需 求 ， 断研 发 出创 新 的产 品 不 不 才 能塑 造 成一 流 的 企业 。因此 建 议 ：
一
是 高起 点创 新 。 占领行 业发展 制 高点 。首 先
是 大 型骨 干企 业 要 凭 借 自身 在 行业 中 的 号 召 力 和
影 响力 。 主动 担 当起 组 织 和 引 领 中 国 农 药 产 业 创 ‘
一
—
一
山东 农 药 信 息
一 坚持农药自新 ． 謇 争取市场话语权
从“ 中国独创农药通用
ｌ
（ 寿县质量技 术监督局 永
据报道 ， 不久， 前 由我 国独 创 的具 有 自主 知 识
暇 过 多 投 入 研 发 ； 业 创 新 受 人 才 、 术 、 金 限 企 技 资 制 ， 能有 效 开 展 等 ， 诸 多 因素 制 约 了我 国农 药 不 这 的 自主 创 新 。《 药 工业 “ 农 十二 五 ” 展 规划 》 出 ， 发 指

1953年， 美国联合炭化公司研制，代谢物有致癌作用。
2021
11
呋喃丹 七十年代， 高毒性
灭多威 七十年代， 中毒
涕灭威 七十年代， 中毒
2021
12
丙硫克百威 七十年代， 中毒
丁硫克百威 七十年代， 中毒
2021
13
茚虫威
1992年杜邦公司开发 2001年正式上市
杀虫机理：钠离子通道 抑制剂 其它属于胆碱酯酶抑制 剂 低毒性、高活性
在美国、澳大利亚等国 家作为“降低风险产品”
2021
14
植物源农药—鱼藤酮的研究进展
• 来源：鱼藤属植物的根部，三大传统植物性杀虫剂之一 （发现于1848年）。作为杀虫剂、杀螨剂、鱼毒使用了 150年。类似物：至今发现近50种。
• 对昆虫尤其是菜粉蝶幼虫、小菜蛾和蚜虫具有强烈的触 杀和胃毒两种作用。鱼藤酮使害虫细胞的电子传递链受
环境影响
– 1992年有一报导，十二只怀孕的北极熊只有五只生产小熊。 北极熊的食物是海豹，海豹的食物是大鱼，大鱼的食物是小鱼， 小鱼吃虾，虾吃海藻，在这过程中，DDT、PCB和其它油溶性 化学药剂浓缩三十亿倍左右；
– 爱斯基摩人吃鱼和熊，因此是全地球人类体内化学污染最严重； 加拿大北岛的Innuit人，免疫功能已失效，儿童们长期耳炎， 经注射疫苗，如天花、麻疹、水痘，也无法产生抗体。
日本农化企业注重对各类农药作用机理及代谢机理的深入研究找出各种酶和作用底物的性质结构反应细胞的培养变异及农药代谢转换分解反应等多方面数据利用电脑虚拟结构设计的方法将高效的活性成分的化学结构异构体进行比对合成叶菌唑和很多除草剂的新品种都是通过作用机理的研究开发出来的
农药创新方法及要素
李玉峰
2021

日本农药创制的诀窍众所周知，新农药创制过程难度大、时间长，还需要投入大量资金。

先正达、拜耳等国际农化巨头称，开发一个新农药需要投入上亿美元甚至更多。

据了解，日本创制费用远低于国际农化巨头。

很多日本公司如日本组合化学、住友化学和曹达化学等，其农药产品的应用效果也很好，占据着较大的国际市场份额。

日本每年约有200～300 个新农药进行登记，日本企业平均从十万个化合物中开发一个新化合物，创制新农药时间约10 年，耗资约50 亿日元（6400 万美元）。

新农药的开发成本，主要为筛选新化合物的开发成本+试验检测该化合物的活性及药效成本+市场推广过程成本。

中化化工科学技术研究总院院长李钟华介绍说，先正达和拜耳等国际农化巨头，在开发新产品上，采用大海捞针式的随机性探究居多，从根本上创新产品结构，成功几率可想而知；而通过收购各地区新化合物的方式，所占研发途径的比例不多。

因此，国际农化巨头研发新产品所耗费的时间较长。

企业与研究单位深度合作在研制、测试及开发新农药过程的多个环节，日企通过与相关高校和研究所深度合作，在控制研发成本在较低水平的同时，也将利益最大化。

李钟华表示，日本农药企业、相关高校和研究所对新化合物的理论研究比较强，具有活性成分的化合物积累数量比较多，在此基础上开发新产品，几率会高很多。

这一合作特点也得到了上海农药研究所教授级高工张一宾的认同。

他表示，日企的新产品研发，大都是与农药合成相关的高校和研究所联合进行的，而高校和研究所的新产品研究费用支出，都是靠政府的科研项目。

多方共同承担研发费用，为企业节省了一部分的研发费用。

出售小试成功化合物再有，新化合物开发出来后，有些产品只进行实验室小试实验，就将化合物出售给其他农药公司，后期的中试、田间试验以及产品市场推广过程中所涉及的费用均不在计算之列。

例如吡虫啉。

李钟华介绍说，20 世纪80 年代，日本特殊农药公司成功开发出全新结构的1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亚胺，其小试表现出很好的活性，而后日本特殊农药公司将其出售给拜耳，中试、田间试验以及开发市场的工作都是拜耳完成的。

植物解毒营养液——绿野
闻一
【期刊名称】《农村科学实验》
【年(卷),期】2004(000)006
【摘要】绿野植物解毒营养液,是长春市吉利农业科技有限公司研制开发的高科技专利产品,几年来在全国十几个省、市推广应用效果十分显著,深受广大农民的信赖和好评,2002年获得国家发明专利证书,同时获得"英国国际联邦专利推广中心认证资历证明",并荣获"世界
【总页数】1页(P21-21)
【作者】闻一
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S482.8
【相关文献】
1.“绿野神”植物营养液产品简介 [J],
2.“绿野神”植物营养液产品简介 [J],
3.“绿野神”植物营养液产品简介 [J],
4.多功能植物固体营养液——保证植物增产增收的法宝 [J],
5.植物动力2003专栏——新型植物营养液植物动力2003应用技术交流会在南汇召开 [J], 区振棠
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发 出 求 救 ： 们 已 经 没 有 力 量 走 下 开 发 成 功 的 呋 喃 虫 酰 肼 ，是 高 效 、 流 。 国应 当借 鉴 日本 、 国进 行农 我 中 韩
去 了 》 文 后 ， 行 业 内 引 起 了 反 低 毒 、环 境 友 好 的 昆 虫 生 长 调 节 药 自主创 新 获 得 成 功 的例 子 。中 国 一 在 响 。更 多从 事 农 药 创 制 工 作 多 年 的 剂 ； 中科 院 上 海 有 机 化 学 所 与浙 江 的这 两 个 邻 居 曾经 都 是 技 术 上 的 后 专 家 从 积 极 的 方 面 肯 定 了 我 国农 基 地 共 同开 发 的具 有 自主 知 识 产 进 者 ，农 药 工 业 都 是 从 引 进 技 术 开 药 创 制 成 果 。他 们 表 示 ： 家 农 药 权 的 原 创 性 高 效 油 菜 田 除 草 始 。但是 ，他们都没有依赖 国外技 国 创 制 中心 成 立 以 来 ， 个 基 地 在农 剂 — — 丙 酯 草 醚 ， 效 果 、 格 、 术 。 各 在 价 药 创 制 领 域 都 取 得 了 不 少 突 破 性 安 全性 等方 面具有 较 强 市场 竞 争 的 成 果 ， 然 目前 各 有 难 处 ， 是 优 势 。 虽 但 大 家都 在 坚 持 。 据 了解 ，早 在 ２ ０世 纪 ６ ０年 代
新农 药产品开发投 资大 、技术
入 ２ ２０万 元 ，推 广 使 用 面 积 达 等 ； ３４ 已合 成 有 活 性 的新 化 合 物 ３ ｏ 难 度 高 、 制 周 期 长 、 险 大 ， 仿 ｏＯ 研 风 而 ５６ ０ ０多 万 亩 次 ， 现 了我 国 具 有 自 多个 ， 实 申请 了中国发明专利 １ 项 ， 制 产 品 受 到 限 制 ，国 内农 药 科 研 单 ９ ２ 主 知 识 产 权 的农 药 品种 零 的 突 破 。 项 国 际 发 明专 利 ， 权 国 内 外 发 明 位 及 企 业 自身 技 术 创 新 能 力 不 足 ， 授

（ ３ ）解决好具体 问题 ，标签 不落地 ，鼓励企 业配置 对 年度抽 查结果 进行整理 ，今年 加大力度 对违法 产 品坚 行管 容器 ，让 农 民更 方便。在对 批准农药登 记 时，要 公 决予 以吊销登记 的处罚 ；协调 解决 农药与 危险化 学 品之
布产 品质量控 制指标 和检 测方法 。发布农药 注册登记 名 间的关 系 ；正在积 极调研 企业差 异化管理 ，对大 企业和 录和 范围，实施农药管理的全方位管理 。
１ 制度安排上面 ，核心是简政放权 ，增强公信 力 ， 消减行政许可。 （ １ ）转变 管理方 式，强化社会监督 。
４ 、在战略 引导层 面 ，通 过政策设计和 安排 ，引导加
（ ２ ）改变方样管理 ，在产品和药 品之 间要做 出有效 快我 国农药产 业从产 品结构 ，组 织结构 和市场 结构 的战
２ 、登记评审方面 ，核心要求是增强透明性 ，着重质 方法 ，为新创制农药的 申请登记有更加宽泛的要求 。
量和效益 。
（ ２ ）探索 实施对 农药企业 的差异 化管理 ，研 究建立
（ １ ）完善审批流程 ，在现有审批流程 中 ，增 加产 品 登记审批引导 的技术壁垒和支持措施 。 企业在文化 、 品牌 、 登记发布前公示 ， 在 审评产 品中， 对新农药或请企业答辩 ， 人才、组织结构和政策获取能力上 的支持措施 。 根据答辩决策投票 ，决定通过不通过 。 目前 ，药检 所 的主要工作 是推进 新农药 管理条 例 出
清醒地 看到 ，随着 工业化 、城镇化 的快 速发展 ，出现 了
（ ４ ）健 全抽查监管机 制 ，组合使用 随机抽查 ，指定
许多新 的情况 ，对农 药行业 发展 提 出了许多新任务 和新 搜查 ，专项抽查 。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ

与开放 合作 的创 新模 式 ，通 过创新 ，不 断开 发 出具 有 生产为基础 ， 以质量为保证 ， 着力 培养 品牌和营销 网络 ， 自主知识产权 的更加高效 、节能 、环保的高技术产品 。 加快建立高效的供销和服务体系 ，扩大 衣化服务业务 ，
二是要积极进行技术改造 ，加快转型升级 。加快转 逐 步建立 从生 产 到使 用 的全 流程服 务体 系。还必 须进
研究 ，逐步 限制 、淘汰高毒 、高污染、高环境风险的农 针对 性地做 好 市场 营销策 略 ，针 对不 同市 场提供差 异
药产 品和工艺技术 。 当前 ， 随着 食品安 全 日益受到关注 ， 化的产 品、服务和推广模 式 ，使 品牌推广 能因地制宜 ， 淘汰落后产 能的要求 日趋迫切 ，国家正在研 究相 关政策 具有针对性 、多样 化 、可行性 ，将 品牌信息从多角度 、
型升级是我 国农药行业 “ 十二五 ”期间发展的核心 。 目 行大规模的宣传推广 ，以提 高品牌在市 场上 的影响力 ， 前我 国农药行业在快速发展过程 中，还存在 重复建设严 要充分利用现代传媒的宣传沟通作用 ，如广告 、杂志报 重 、产能过剩 、行业结构性矛盾突 出、经营秩序混乱等 刊 、 广播 电视 、 宣传促销活动及各种推广会 、 览会等 ， 展 问题 ，严重影 响了农药行业的可持续发展 。 农药产业 将企 业独 特和 整体 的 品牌 形象 传播 给经销 商和 农 民。 政策 》也提 出要加快高安全 、低风险产品和应用技术的 企业 要顺 应农 民消 费 习惯 和水 平 以及需 求的变 化 ，有
民信赖的 品牌 。 总之 。在 “ 十二五”期间 ，希望有更多 的农化企业
随着相关政策 的逐步推进 ，必将会进 一步加快农药行业
整合步伐 ， 如果还继续沉溺于 “ 生存而 生存 ”的怪 圈 ， 积极行动起来 ， 持 “ 为 坚 人无我有 ，人有我优 ， 人优我精”

序 列结 构与 功能应 用 之间 的关 系 。 几十 年前 ， 农药 研 究 中的新化 合物 的构 效关 系 ， 也 包含 这层 意思 ， 只不
生物信息学是一 门＿ ［ 程技术科学 ， 可以理解为 ： 生物学 ＋ 信息学ｆ 计算机科学及应用） 。生物信息学 的研究对象是生物数据 ，其中最经典 的是分子生物 学数据 ，也就是基因组技术的产物——Ｄ Ｎ Ａ序列 。
２ ０ ０ ０ ３ ０ ）
２ ０ １ ６ ２ ０ ） 上海市化工科学技术情报研究所 （ 上海
概述了生物信息学近年的发展 ， 特别提到新农药 的创制工作一定要有生物信 息平 台提供的资料为引导。生 物信息学对生命科学各有关学科 产生越来越广泛 、 深刻 的影响 。 生物 信息学
Ｔ Ｑ４ ５
一
生物信息学通过对生物学实验数据 的获取 、 加 工、 储存 、 联 网、 检索 与分 析 ， 科 学准 确地 揭示 数据 蕴 含的深刻的生物学意义 ，最终达到探寻与解读生命
活 动规律 的 目的 ， 提 高科 学研 究 的预测 能力 。
门新 的分支 学科— —农 药基 因组 学 。 自从 １ ９ ９ ０年 美 国启动 人类 基 因组 计 划 以来 ， 海
上 海 化 丁
Ｓｈ ａ ｎｇ ｈ ａ ｉ Ｃｈ ｅ ｍｉ ｅ Ｍ Ｉ ｎｄ ｕｓ ｔ ｒ ｙ
Ｖ ０ １ ＿ ３ ８ Ｎｏ ． １
Ｊ ａ ｎ ． ２ ０ １ ３
大论能倾海 ・ 奇才会补天
— —
生物信息学与新农药创制
徐 子 成 陈思 浩
上海工程技术大学 （ 上海
摘 要
涂 闽
量 的生物学序列数据像潮水般涌来。 美国２ ０ １ １ 年公 布的 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ 数据库版本拥有的 Ｄ Ｎ Ａ序列总量 已 超过 １ ２ ６ ５ 亿碱基对 ，基于序列 的生物学时代 已经 到来。 序列数据是信息和知识的源泉 ， 但并不等于信 息和知识 ，挖掘蕴藏在这大量序列数据中的科学规 律， 正是生物信息学的学科内涵 ， 也就是要深入分析

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施
新 农药创制取 得 了 初步成效
,
已 有十 多 个创制 品
。
1 0 0 0 11
)
P e s t i e i d e 15 t h e m o r e
n e
种 进 人产业 化 开发 阶段
种 绝 大部 分将 在
居 安 思危
提 高 农 作 物 的抗劣 性 能 改 革 开 放 以来
.
改善 和 提高农作 物
,
只 有创 制 出 具 有 自 主 知 识 产 权 的 农
。
。
,
我 国农药 工 业 有 了长 足 的进
19 9 8
, ,
药新 品 种 才 是 保证 我 国 农 药 工 业 和 农 业 生 产 可 持 续
发展 的 唯 一 出 路
仪器
。
其 中沈 阳 化 工 研 究 院拥 有 较 为 完 善 的 从 新化
、
通 过 国 家在 支持
,
十五
”
期 间 对 新农 药创 制工 作 的
合 物合 成
剂 型 加工
、
化合 物 生 物 活 性 评 价 到 农药
;
组 合 化学 合 成 和 高通 量 筛选 技 术 等 世 界上 最
安 全性 评 价 的 新 农药 创 制 开发 体系
。
,
在 国民经 济
又 会 形 成 多 家企业 同时 生产
、
,
造成 产 品 竞
使用 农药 不 仅可 以 避 免各

目前 ， 嘧 磺 隆 、 嘧 磺 酯 均 实 现 了产 业 化 生 产 ， 括 原 药 和 制 剂 在 内 的 ６个 品 种 获 得 国 家新 农 药 三 单 单 包 证 ， 准 进 入 市 场 。 申请 国家 发 明 专 利 ８项 。 获 ６项 已获 授权 。 ２０ ０ １年 至 ２ ０ ０ ６年期 间 ， 两类 绿 色农 药在 山东 、 南 、 龙 江 、 苏 、 津 、 蒙 古 、 宁 、 这 河 黑 江 天 内 辽 吉林 、 北 等 河
成 为农 药 史 上 的 里 程 碑 。迄 今 为 止 ， 国 、 美 日本 、 士 开 发 的 磺 酰 脲 类 除 草 剂 已有 十 余 种 。我 国 不 少 企 业 对 瑞 国外 品种 进 行 仿制 ， 缺 乏 自主 知识 产 权 。 但
上世纪 ９ ０年 代 初 ， 正 名 院 士 研 究 组 开 始 对 磺 酰 脲 类 除 草 剂 进 行 系 统 的研 究 ， 用 与 国 外 不 同 的 优 李 利
程。
单 嘧 磺 隆 和 单 嘧磺 酯 的毒 性 极 低 ， 对人 畜 和环 境 安 全 。 室 内 试验 证 实 ， 嘧 磺 隆 与 杜 邦 公 司 的氯 磺 隆 、 磺 隆 、 草 隆 的 活性 相 当 ， 玉 米 和 谷 子 的安 全性 优 单 甲 豆 对 于 氯磺 隆 和苯 磺 隆 。２ ０ 年 ， 嘧磺 隆被 科 技 部 列 为 国家 重 点 推 广 项 目。 ０１ 单
地 推 广 １０多 万 亩 ， 大 减 少 农 民 的 劳 动强 度 和草 害造 成 的作 物 损 失 ， 计 为 农 民 创 造 社 会 经 济 效 益 ７ ０ ３ 大 累 ００
多万 元 。
２０ ０ ７年 成 为 “ 国农 药 工业 杰 出成 就 奖 ” 届 获 奖 人 的李 正 名 院 士 说 ， 国在 农 药 创 制 领 域 实 力 较 弱 ， 中 首 我

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(４):１０３６￣１０４２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ赵为民ꎬ戴超辉ꎬ陈㊀哲ꎬ等.ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(４):１０３６￣１０４２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０４.０１３ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因赵为民１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀戴超辉１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀陈㊀哲１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀涂㊀枫１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀李㊀辉１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀付言峰１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀李碧侠１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀任守文１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀程金花１ꎬ２ꎬ３(１.江苏省农业科学院畜牧研究所ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.江苏省农业种质资源保护与利用平台ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ３.农业农村部种养结合重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣０８￣１９基金项目:江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[ＪＢＧＳ(２０２１)０９９]ꎻ扬州市重点研发项目(现代农业)(ＹＺ２０２１０３７)ꎻ国家生猪产业技术体系项目(ＣＡＲＳ￣ＰＩＧ￣３５)ꎻ江苏省农业重大新品种创制项目(ＰＺＣＺ２０１７３３)作者简介:赵为民(１９８３－)ꎬ男ꎬ湖北钟祥人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事猪抗病育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｏ＿ｗｅｉｍｉｎ１９８３＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍ通讯作者:程金花ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｈｃｈｅｎｇ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀本研究利用ＲＴ￣ＰＣＲ检测ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因表达在细胞中的亚定位ꎬ采用５ᶄＲＡＣＥ获得ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的转录起始位点ꎻ利用ＣＲＩＳＰＯＲ软件对－３００~０ｂｐ区域的ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子序列设计ｓｇＲＮＡ并构建到ｐｘ３３０载体ꎬ通过转染细胞与Ｔ７Ｅ１酶切验证ｓｇＲＮＡ效率ꎻ利用酶切和亚克隆方法将ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ片段替换ｐｘ３３０载体的Ｃａｓ９序列ꎬ形成重组ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎻ将验证有效的ｓｇＲＮＡ构建到ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎬ形成ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ꎮ添加不同质量浓度的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理细胞ꎬ以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度ꎮ转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体并用ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄ后进行ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达检测ꎬ同时对ｓｇＲＮＡ在ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子上的结合位点进行Ｓａｎｇｅｒ测序ꎬ以进一步验证上述结合位点是否发生切割ꎮ结果显示ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１主要表达于细胞核ꎬ而在细胞质中几乎不表达ꎮ５ᶄＲＡＣＥ获得了Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１５ᶄ端大约２７０ｂｐ的序列ꎮｑＰＣＲ检测结果显示ꎬ与对照组相比ꎬｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２能够显著抑制Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达(Ｐ<０ ０５)ꎮＳａｎｇｅｒ测序结果表明ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２所在的位点并没有发生碱基缺失和插入ꎮ研究结果为后续进一步研究ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在先天性免疫反应中的功能奠定了基础ꎮ关键词:㊀ＣＲＩＳＰＲꎻｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎻＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因ꎻ猪ꎻ基因沉默中图分类号:㊀Ｓ８５２.２８㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０４￣１０３６￣０７ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｐｉｇＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｂｙＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｓｙｓｔｅｍＺＨＡＯＷｅｉ￣ｍｉｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＤＡＩＣｈａｏ￣ｈｕｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＺｈｅ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＴＵＦｅｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＨｕｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＦＵＹａｎ￣ｆｅｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＢｉ￣ｘｉａ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＲＥＮＳｈｏｕ￣ｗｅｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＧＪｉｎ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ３(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＪｉａｎｇｓｕＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎＰｌａｔｆｏｒｍꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐａｎｄＬｉｖｅｓｔｏｃｋＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｓｕｂ￣ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲ.ＡｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｉｔｅｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｗａｓｏｂ￣ｔａｉｎｅｄｂｙ５ᶄＲＡＣＥ.ＴｈｅＣＲＩＳＰＯＲｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅ￣ｓｉｇｎｔｈｅｓｇＲＮＡｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｗｉｔｈｉｎ－３００~０ｂｐｒｅｇｉｏｎ.ＴｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｓｇＲＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｐｘ３３０ꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｓｇＲＮＡｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓａｎｄＴ７Ｅ１ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ.Ｃａｓ９ｆｒａｇ￣ｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｘ３３０ｖｅｃｔｏｒｗａｓｒｅｐｌａｃｅｄｂｙｔｈｅｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣６３０１ＢＳＤｆｒａｇｍｅｎｔｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇｔｏｆｏｒｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒ.ＩｔｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｇＲＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒｔｏｆｏｒｍｔｈｅｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒ.ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ.Ａｎｄｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｍｉｎｉ￣ｍｕｍｌｅｔｈａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓ.ＡｆｔｅｒｓｅｖｅｎｄａｙｓｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｅｌｌｓｗｉｔｈＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ.ＭｅａｎｗｈｉｌｅꎬｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｏｆｓｇＲＮＡｏｎｔｈｅＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｆｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｙｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅａｂｏｖｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｗａｓｃｌｅａｖｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｗａｓｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓꎬｂｕｔｈａｒｄｌｙｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ.Ｔｈｅ５ᶄＲＡＣＥｏｂｔａｉｎｅｄａｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２７０ｂｐａｔｔｈｅ５ᶄｅｎｄｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１.ＴｈｅｑＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１(Ｐ<０.０５).ＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｄｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓａｔｔｈｅｓｉｔｅｓｗｈｅｒｅｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｗｅｒｅｌｏｃａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＣＲＩＳＰＲꎻｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎻＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅꎻｐｉｇꎻｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ㊀㊀长链非编码ＲＮＡ(Ｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡꎬＬｎ￣ｃＲＮＡ)是一类本身不编码蛋白㊁转录本长度超过２００ｂｐ的ＲＮＡꎮ研究结果表明ＬｎｃＲＮＡ参与了Ｘ染色体失活㊁胚胎发育㊁基因印记㊁癌症㊁免疫等各种细胞生命活动[１￣５]ꎮ近年来大量畜禽相关的ＬｎｃＲＮＡ被鉴定出来ꎬ这些ＬｎｃＲＮＡ紧密参与了畜禽肌肉发育㊁免疫调控㊁繁殖等重要性状[６￣９]ꎬ注释和解析这些ＬｎｃＲＮＡ的功能对进一步挖掘调控畜禽重要经济性状的功能元件具有深远意义ꎮ然而大多数ＬｎｃＲＮＡ定位于细胞核ꎬ而ＲＮＡｉ的工作系统主要在细胞质中发挥作用ꎬ对定位于细胞核的ＬｎｃＲＮＡ作用非常有限[１０￣１２]ꎬ这限制了ＬｎｃＲＮＡ的功能解析ꎮＣＲＩＳＰＲｉ系统通过核酸酶活性失活的Ｃａｓ９(ｄＣａｓ９)和ｓｇＲＮＡ的复合物结合到某个基因的转录起始位点(ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅꎬＴＳＳ)附近ꎬ物理性阻碍ＲＮＡ聚合酶的通过ꎬ从而导致基因沉默[１３]ꎮ通过ｄＣａｓ９融合基因抑制结构域如ＫＲＡＢ(Ｋｒüｐｐｅｌ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｏｘ)ꎬ形成ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ复合结构ꎬ可进一步提高转录抑制的效率[１４￣１６]ꎮＬｉｕ等[１７]利用ＣＲＩＳＰＲｉ系统鉴定了数百个与细胞生长相关的Ｌｎ￣ｃＲＮＡꎬＫｌａｎｎ等[１８]利用ＣＲＩＳＰＲｉ系统鉴定了大量与基因表达调控相关的功能元件ꎮＣＲＩＳＰＲｉ系统在抑制基因表达上也呈现出较强的特异性[１９￣２０]ꎬ是研究ＬｎｃＲＮＡ功能的新一代工具ꎮＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１是在研究肌细胞分化时发现的一个长链非编码ＲＮＡ[２１]ꎬ其作为核心组分主要参与细胞亚结构旁斑(Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ)的形成ꎬ在细胞分化ꎬ癌症发生和病毒感染等生物学过程中发挥着重要作用[２１￣２３]ꎮ本课题组前期研究结果表明猪Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因在脂蛋白刺激下表达显著上调ꎬ表明其在Ｔｏｌｌ样受体２(ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＴＬＲ２)介导的先天性免疫反应中可能起到调控作用[２４]ꎮ本研究利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统来抑制Ｌｎ￣ｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达ꎬ为后续进一步研究其在先天性免疫反应中的功能奠定基础ꎮ１㊀材料和方法１.１㊀细胞、菌株与质粒Ｔｒａｎｓ５ａ感受态菌株购于北京擎科生物科技有限公司ꎬＬｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体由华中农业大学赵长志惠赠ꎬ猪ＰＫ１５细胞㊁ｐｘ３３０载体由本实验室保存ꎮ１.２㊀试剂ＲＮＡ提取试剂盒购于南京诺唯赞医疗科技有限公司ꎻＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＮＡｍａｒｋｅｒ购于北京擎科生物科技有限公司ꎻ内切酶ＢｂｓＩ㊁Ｔ７Ｅ１酶购于ＮＥＢ公司ꎻＰＣＲ酶㊁Ｔ载体㊁末端转移酶ＴｄＴ㊁Ｔ４连接酶㊁ｑＰＣＲ试剂㊁反转录试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司ꎻ无内霉毒素质粒试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司ꎻＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳＨＣｌ(灭瘟素Ｓ)购于南京碧云天生物技术有限公司ꎻＤＮＡ纯化回收试剂盒购于ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈＺｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ＿安诺伦(北京)生物科技有限公司公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁青链霉素购于武汉博士德生物工程有限公司ꎻ胎牛血清购于ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ(ＢＩ)公司ꎻｏｐｔｉ￣ＭＥＭ和ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ３０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司ꎮ１.３㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的亚细胞表达分布待细胞密度长至８０％左右ꎬ胰酶消化细胞ꎬ用预冷７３０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因ＰＢＳ清洗两遍后加入ＢｕｆｆｅｒＡ(１０ｍｍｏｌ/Ｌｔｒｉｓ￣ｃｌꎬ１０ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ０ ５％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ￣６３０)ꎬ冰上放置５ｍｉｎꎬ离心后上清液用于细胞质ＲＮＡ的提取ꎮ用ＢｕｆｆｅｒＡ洗涤沉淀２次ꎬ沉淀用于细胞核ＲＮＡ的提取ꎮ１.４㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的５ᶄ末端快速扩增(５ᶄＲＡＣＥ)㊀㊀基于前期测序获得部分序列结果[２４]ꎬＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的５ᶄ末端快速扩增过程如下:利用ｏｌｉ￣ｇｏｄＴ反转录ｃＤＮＡ第一链ꎬ然后再利用ＴｄＴ酶进行５ᶄ末端ｄＣ￣ｔａｉｌｉｎｇꎬ回收纯化后ꎬ用引物５Ｐ(５ᶄ￣ＡＡＧ￣ＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ￣３ᶄ)和５ᶄ末端的特异性引物５ᶄＧＳＰ(５ᶄ￣ＣＴＧＣＣＴＣ￣ＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＧ￣３ᶄ)扩增其５ᶄ末端ꎮＰＣＲ扩增条件:９５ħ５ｍｉｎꎬ９５ħ３０ｓꎬ６５ħ(－０.５ħ)４５ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ１５个循环ꎻ９５ħ１ｍｉｎꎬ６０ħ４５ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ２０个循环ꎻ７２ħ３ｍｉｎꎮ扩增的ＰＣＲ产物经过ＤＮＡ纯化回收后与Ｔ载体连接ꎬ然后转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证ꎮ１.５㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子区域的ｓｇＲＮＡ设计㊀㊀针对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因启动子区(－３００~０ｂｐ)利用ＣＲＩＳＰＯＲ(ｈｔｔｐ://ｃｒｉｓｐｏｒ.ｔｅｆｏｒ.ｎｅｔ/)在线设计２对ｓｇＲＮＡꎮ设计原则为选取ｃｆｄＳｐｅｃＳｃｏｒｅ>８０ꎬＤｏｅｎｃｈᶄ１６￣Ｓｃｏｒｅ>５０的ｓｇＲＮＡꎮ１.６㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ质粒构建依据ｓｇＲＮＡ的序列合成反向互补的单链寡核苷酸ｓｇＦ和ｓｇＲꎬ并在ｓｇＦ的５ᶄ端添加ＣＡＣＣＧꎬ在ｓｇＲ的５ᶄ端添加ＡＡＡＣꎮ９５ħ变性５ｍｉｎꎬ室温冷却ꎬ使ｓｇＦ和ｓｇＲ退火互补ꎮＢｂｓⅠ酶切ｐｘ３３０载体ꎬ回收纯化后与退火的寡核苷酸连接ꎬ转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证与无内霉毒素质粒提取ꎮ１.７㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体构建通过酶切ｐｘ３３０载体ꎬ将Ｃａｓ９序列替换为多克隆位点ꎬ然后再将ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ插入到该多克隆位点ꎮ具体方法如下:首先以ｐｘ３３０载体为模板ꎬ通过引物Ｆ:５ᶄ￣ＴＴＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣ￣ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡ￣３ᶄ和Ｒ:５ᶄ￣ＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴ￣３ᶄ进行ＰＣＲ扩增ꎮＰＣＲ产物包含引入了多个酶切位点(引物Ｆ下划线部分)的ｂＧＨｐｏｌｙ(Ａ)片段ꎮ然后对ＰＣＲ产物和ｐｘ３３０载体分别进行ＡｇｅⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切并进行连接ꎬ转化Ｔｒａｎｓ５ａ感受态细胞ꎬ后续进行测序验证与质粒提取ꎮ此重组后的载体为ｐｘ３３０￣ＭＣＳꎮ将筛选好的ｓｇＲＮＡ先构建到ｐｘ３３０￣ＭＣＳꎬ为ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳꎮ然后对ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳ和Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ进行ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎬ将Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体中的ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ连接到ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ＭＣＳ中ꎬ形成重组载体ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎮ１.８㊀ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度摸索猪ＰＫ１５细胞铺板１２孔板ꎬ２４ｈ后待细胞密度达到８０％左右ꎬ分别添加０μｇ/ｍｌ㊁１μｇ/ｍｌ㊁３μｇ/ｍｌ㊁４μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎬ每个质量浓度处理３次重复ꎬ每２ｄ换１次ꎬ在第７ｄ时观察细胞的死亡情况ꎬ使细胞致死的最小剂量为后续的药筛质量浓度ꎮ１.９㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的沉默猪ＰＫ１５细胞在转染前１ｄ铺１２孔板ꎬ转染时密度大约７０％ꎮ对照组转染ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢꎬ实验组分别转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ１￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ和ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ２￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ质粒ꎬ４８ｈ后ꎬ利用ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄ后进行ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达检测ꎮ１.１０㊀定量ＰＣＲ１μｇＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎬ使用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５进行ｑＰＣＲ扩增ꎮ对照组与试验组各３个生物学重复ꎬ每个样品重复３次ꎮ采用三步法扩增ꎬ程序简要如下:预变性９５ħ２ｍｉｎꎬ９５ħ１５ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ７２ħ３０ｓꎬ４０个循环ꎮ数据均以平均值ʃ标准差表示ꎮ使用单因素方差分析各组之间的差异显著性ꎮ引物序列见表１ꎮ表１㊀引物序列信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ基因㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增长度(ｂｐ)ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１Ｆ:ＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＣＴＧ６０１６５Ｒ:ＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＣＨＰＲＴＦ:ＣＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧＡ６０１９１Ｒ:ＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣ２㊀结果与分析２.１㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达的亚细胞定位利用低渗溶液将细胞总ＲＮＡ分为细胞质和细８３０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期胞核ＲＮＡꎬＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达于细胞核ꎬ在细胞质中几乎不表达(图１)ꎮＨＰＲＴ作为细胞内参基因ꎬ其在细胞核内转录后会向细胞质中运输ꎬ其ｍＲＮＡ在细胞质中的表达量多于细胞核ꎮ图１结果显示ＨＰＲＴ在细胞质的表达量高于细胞核ꎬ符合其表达定位ꎮ图１㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在细胞质与细胞核中的表达Ｆｉｇ.１㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓ２.２㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１转录起始位点为了确定ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的转录起始位点ꎬ通过５ᶄＲＡＣＥ对其５ᶄ端序列进行了克隆ꎬ图２结果显示得到大约２７０ｂｐ的条带ꎬ与预期相符ꎮ图２㊀ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的５ᶄＲＡＣＥ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀５ᶄＲＡＣＥａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１２.３㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区的ｓｇＲＮＡ设计与效率验证㊀㊀通过ＣＲＩＳＰＯＲ在线设计程序ꎬ对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区(－３００~０ｂｐ)设计了２对ｓｇＲＮＡꎬ分别为ｓｇＲＮＡ１:５ᶄ￣ＣＣＧＡＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＡ￣３ᶄꎬＰＡＭ为ＧＧＧꎬ位置约－２００ｂｐꎬＤｏｅｎｃｈ１６￣Ｓｃｏｒｅ参数为６３ꎻｓｇＲＮＡ２:５ᶄ￣ＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴ￣ＧＡＣＧ￣３ᶄꎬＰＡＭ为ＣＧＧꎬ位置约－１５０ｂｐꎬＤｏｅｎｃｈ１６￣Ｓｃｏｒｅ参数为６３ꎮ２.４㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体的酶切验证图３显示构建的ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ经过ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后ꎬ得到约４２００ｂｐ的ｐｘ３３０骨架和５０００ｂｐ的ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ＢＳＤ片段ꎬ与预期相符ꎮＭ:ＤＮＡ相对分子质量标准样品ꎻ１:ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ１￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎻ２:ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ２￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ载体ＢｓｉＷⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ꎮ图３㊀ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ质粒的酶切鉴定Ｆｉｇ.３㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢｐｌａｓｍｉｄｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ２.５㊀ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度的确定图４结果显示ꎬ在加ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ培养７ｄ后ꎬ１μｇ/ｍｌ质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理的细胞只有部分细胞死亡(图４Ｂ)ꎬ而３μｇ/ｍｌ与４μｇ/ｍｌ质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ处理的的细胞几乎全部死亡(图４Ｃ㊁图４Ｄ)ꎬ因此在后续的筛选中ꎬＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ筛选质量浓度为３μｇ/ｍｌꎮ图４Ａ为阴性对照组ꎬ细胞生长正常ꎮ２.６㊀ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达㊀㊀细胞转染ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ(试验组)与ｐｘ３３０￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ(对照组)３６ｈ后ꎬ添加Ｂｌａｓｔｉ￣ｃｉｄｉｎＳ筛选细胞７ｄꎬ对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达进行ｑＰＣＲ检测ꎮ结果(图５)显示ꎬ与对照组相比ꎬｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２分别使ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１表达下降了７３％和５５％ꎬ达到显著水平(Ｐ<０ ０５)ꎮ９３０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因Ａ:阴性对照组ꎻＢ:１μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎻＣ:３μｇ/ｍｌ的Ｂｌａｓｔｉｃｉ￣ｄｉｎＳꎻＤ:４μｇ/ｍｌ的ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳꎮ图４㊀不同质量浓度ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＳ对细胞的致死效果Ｆｉｇ.４㊀ＴｈｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢｌａｓｔｉｃｉ￣ｄｉｎＳｏｎｃｅｌｌｓ∗表示与对照组相比差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ图５㊀ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２对ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的沉默效果Ｆｉｇ.５㊀ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｓｇＲＮＡ１ａｎｄｓｇＲＮＡ２ｏｎＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１ｇｅｎｅ２.７㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区的切割验证为了进一步验证ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统中的ｓｇＲＮＡ是否会切割其结合位点ꎬ利用Ｓａｎｇｅｒ测序对ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２的结合位点进行分析ꎮ结果(图６)显示试验组中ｓｇＲＮＡ１和ｓｇＲＮＡ２的结合位点和对照组一致ꎬ其序列没有发生碱基缺失或者插入ꎮ３㊀讨论近年来随着重测序以及功能基因组学的发展ꎬ猪相关的ＬｎｃＲＮＡ与增强子等被大量鉴定出来[６ꎬ２５]ꎮＣＲＩＳＰＲｉ与ＲＮＡｉ和ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９敲除相比ꎬ在研究细胞核内相关的ＬｎｃＲＮＡ或表达增强子(Ｅｎｈａｎｃｅｒ￣ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡｓꎬｅＲＮＡｓ)上有着较大优势[１２ꎬ１５]ꎬ并且也可以进行高通量的筛选研究ꎬ为解析猪功能基因组以及挖掘重要调控元件奠定基础ꎮＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１在最初发现时定位于小鼠肌细胞核内ꎬ作为核心组分主要参与细胞亚结构旁斑(Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ)的形成[２１]ꎮ本试验发现猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１几乎只表达于细胞核ꎬ表明ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达定位在物种间相对保守ꎮ由于Ｌｅｎｔｉ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ￣ｂｌａｓｔ载体较大(约１４ｋｂ)ꎬ如果再联合转染ｓｇＲＮＡ表达载体ꎬ会导致转染效率低ꎬ从而会影响基因沉默效果ꎮ本研究通过酶切与亚克隆构建了ｐｘ３３０￣ｓｇＲＮＡ￣ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ这种 Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ 载体ꎬ将ｓｇＲＮＡ和ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ表达元件都整合到一个载体ꎬ大幅度缩减了载体ꎬ提高了表达效率[２６￣２７]ꎬ从而进一步提升沉默效果ꎮ位于ＴＳＳ不同位置的ｓｇＲＮＡ对ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ的沉默效果具有决定性作用[１５ꎬ２８]ꎮ因此本研究首先利用５ᶄＲＡＣＥ确定了ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的ＴＳＳꎮ由于大多数编码ＬｎｃＲＮＡ基因ꎬ其表达水平相对于编码蛋白基因较低[２９￣３１]ꎬ确定这些重要而表达水平较低的ＬｎｃＲＮＡ的ＴＳＳ并不容易ꎬ这也是利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默ＬｎｃＲＮＡ一个限制因素ꎮＴＳＳ附近启动子区对基因表达水平有重要影响ꎬ其区域内碱基的删除或插入会影响其基因的表达[３２￣３４]ꎮ尽管ｄＣａｓ９呈现失活的状态ꎬ并不会切割ｓｇＲＮＡ的结合位点[１３]ꎬ为了进一步验证ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达下调不是由于ｓｇＲＮＡ切割ＴＳＳ附近启动子区造成的ꎬ本研究利用Ｓａｎｇｅｒ测序对试验组ｓｇＲＮＡ的结合位点进行序列分析ꎬ结果显示其结合位点并没有发生删除或者插入ꎬ表明ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１的表达下调是通过ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统来实现ꎮ本研究获得了ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的ＴＳＳ位点ꎬ在其附近启动子区设计并验证了２对有效ｓｇＲＮＡꎬ通过构建 Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ 载体ꎬ利用ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统有效沉默了猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因的表达ꎮ参考文献:[１]㊀ＬＯＤＡＡꎬＨＥＡＲＤＥ.ＸｉｓｔＲＮＡｉｎａｃｔｉｏｎ:ｐａｓｔꎬｐｒｅｓｅｎｔꎬａｎｄｆｕ￣ｔｕｒｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔꎬ２０１９ꎬ１５(９):ｅ１００８３３３. [２]㊀ＫＵＡＮＧＬＤꎬＬＥＩＭꎬＬＩＣＹꎬｅｔａｌ.Ｗｈｏｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎ￣ｃｉｎｇｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓａｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｅｍｂｒｙｏｍｏｒｐｈｏ￣ｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｒａｂｂｉｔｓ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２０ꎬ１１２(３):２２０３￣２２１２.０４０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期图６㊀猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１启动子区ｓｇＲＮＡ结合位点的Ｓａｎｇｅｒ测序峰图Ｆｉｇ.６㊀ＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｅａｋｍａｐｏｆｓｇＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｐｉｇＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１[３]㊀ＭＡＣＤＯＮＡＬＤＷＡꎬＭＡＮＮＭＲＷ.ＬｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌｉｔｙｉｎｉｍｐｒｉｎｔｅｄｄｏｍａｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔꎬ２０２０ꎬ１６(８):ｅ１００８９３０.[４]㊀ＬＩＵＢꎬＳＵＮＬꎬＬＩＵＱꎬｅｔａｌ.ＡｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＮＦ￣κＢｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｂｌｏｃｋｓＩκＢｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ２７(３):３７０￣３８１.[５]㊀ＸＵＨꎬＪＩＡＮＧＹꎬＸＵＸꎬｅｔａｌ.ＩｎｄｕｃｉｂｌｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＬｎｃＲＮＡｓｒｏｓ１ｐｒｏｍｏｔｅｓＩＦＮ￣γ￣ｍｅｄｉａｔｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｓｂｙｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｓｔａｔ１ｍＲＮＡ[Ｊ].ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１９ꎬ２０(１２):１６２１￣１６３０.[６]㊀ＪＩＮＬꎬＴＡＮＧＱꎬＨＵＳꎬｅｔａｌ.ＡｐｉｇＢｏｄｙＭａｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｒｅ￣ｖｅａｌｓｄｉｖｅｒｓｅｔｉｓｓｕｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):３７１５.[７]㊀ＧＡＯＪꎬＰＡＮＹꎬＸＵＹꎬｅｔａｌ.Ｕｎｖｅｉｌｉｎｇｔｈｅｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｐｒｏｆｉｌｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ￣ｉｎ￣ｆｅｃｔｅｄｐｏｒｃｉｎｅａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ２２(１):１７７.[８]㊀ＬＩＵＪꎬＺＨＯＵＹꎬＨＵＸꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｐｒｏｆｉｌｅｏｆＬｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｄｕｒｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ２０２１ꎬ１２:６６０３７０.[９]㊀ＤＵＺＱꎬＥＩＳＬＥＹＣＪꎬＯＮＴＥＲＵＳＫꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｐｅ￣ｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｐｉｇｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓｕｓｉｎｇＲＮＡ￣ｓｅｑ[Ｊ].ＡｎｉｍＧｅｎｅｔꎬ２０１４ꎬ４５(２):１９８￣２０４.[１０]ＤＥＲＲＩＥＮＴꎬＪＯＨＮＳＯＮＲꎬＢＵＳＳＯＴＴＩＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＧＥＮＣＯＤＥｖ７ｃａｔａｌｏｇｏｆｈｕｍａｎｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ:ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｒｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２０１２ꎬ２２(９):１７７５￣１７８９.[１１]ＦＡＴＩＣＡＡꎬＢＯＺＺＯＮＩＩ.Ｌｏｎｇｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ:ｎｅｗｐｌａｙｅｒｓｉｎｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔꎬ２０１４ꎬ１５(１):７￣２１.[１２]ＢＯＥＴＴＣＨＥＲＭꎬＭＣＭＡＮＵＳＭＴ.Ｃｈｏｏｓｉｎｇｔｈｅｒｉｇｈｔｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｊｏｂ:ＲＮＡｉꎬＴＡＬＥＮꎬｏｒＣＲＩＳＰＲ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ５８(４):５７５￣５８５.[１３]ＱＩＬＳꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬｅｔａｌ.ＲｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲａｓａｎＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５２(５):１１７３￣１１８３.[１４]ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＬＡＲＳＯＮＭＨꎬＭＯＲＳＵＴＬꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅ￣ｄｉａｔｅｄｍｏｄｕｌａｒＲＮＡ￣ｇｕｉｄｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｅｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１３ꎬ１５４(２):４４２￣４５１.[１５]ＧＩＬＢＥＲＴＬＡꎬＨＯＲＬＢＥＣＫＭＡꎬＡＤＡＭＳＯＮＢꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅＣＲＩＳＰＲ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１４ꎬ１５９(３):６４７￣６６１.[１６]ＡＬＥＲＡＳＯＯＬＮꎬＳＥＧＡＬＤꎬＬＥＥＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔＫＲＡＢｄｏｍａｉｎｆｏｒＣＲＩＳＰＲｉａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＮａｔＭｅｔｈ￣ｏｄｓꎬ２０２０ꎬ１７(１１):１０９３￣１０９６.[１７]ＬＩＵＳＪꎬＨＯＲＬＢＥＣＫＭＡꎬＣＨＯＳＷꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲｉ￣ｂａｓｅｄｇｅ￣ｎｏｍｅ￣ｓｃａｌｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｌｏｃｉｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ３５５(６３２０):７１１１.[１８]ＫＬＡＮＮＴＳꎬＢＬＡＣＫＪＢꎬＣＨＥＬＬＡＰＰＡＮＭꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｅｎａｂｌｅｓｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].ＮａｔＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１７ꎬ３５(６):５６１￣５６８.[１９]ＴＨＡＫＯＲＥＰＩꎬＤＩＰＰＯＬＩＴＯＡＭꎬＳＯＮＧＬꎬｅｔａｌ.ＨｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｅｐｉｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｂｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓｆｏｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｄｉｓｔａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１５ꎬ１２(１２):１１４３￣１１４９.[２０]ＭＡＮＤＥＧＡＲＭＡꎬＨＵＥＢＳＣＨＮꎬＦＲＯＬＯＶＥＢꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ１４０１赵为民等:ＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ＫＲＡＢ系统沉默猪ＬｎｃＲＮＡ￣ＮＥＡＴ１基因Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｎｄｕｃｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｉＰＳＣｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２０１６ꎬ１８(４):５４１￣５５３. [２１]ＳＵＮＷＯＯＨꎬＤＩＮＧＥＲＭＥꎬＷＩＬＵＳＺＪＥꎬｅｔａｌ.Ｍｅｎｅｐｓｉｌｏｎ/ｂｅｔａｎｕｃｌｅａｒ￣ｒｅｔａｉｎｅｄｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓａｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｐｏｎｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＲｅｓꎬ２００９ꎬ１９(３):３４７￣３５９.[２２]ＩＭＡＭＵＲＡＫꎬＩＭＡＭＡＣＨＩＮꎬＡＫＩＺＵＫＩＧꎬｅｔａｌ.Ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄ￣ｉｎｇＲＮＡＮＥＡＴ１￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＳＦＰＱｒｅｌｏｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｔｏｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｍｅｄｉａｔｅｓＩＬ８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｕｐｏｎｉｍｍｕｎｅｓｔｉｍｕｌｉ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ５３(３):３９３￣４０６.[２３]ＬＩＫꎬＹＡＯＴꎬＺＨＡＮＧＹꎬｅｔａｌ.ＮＥＡＴ１ａｓａｃｏｍｐｅｔｉｎｇｅｎｄｏｇｅ￣ｎｏｕｓＲＮＡｉｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃａｎｃｅｒｓ:ｒｏｌｅꎬｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ[Ｊ].ＩｎｔＪＢｉｏｌＳｃｉꎬ２０２１ꎬ１７(１３):３４２８￣３４４０.[２４]赵为民ꎬ方晓敏ꎬ涂㊀枫ꎬ等.猪单核源性巨噬细胞受ＦＳＬ￣１刺激后ｌｎｃＲＮＡｓ的鉴定与特征分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１９ꎬ３５(２):３４６￣３５６.[２５]ＺＨＡＯＹꎬＨＯＵＹꎬＸＵＹꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｉｓ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｐｉｇｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):２２１７.[２６]ＳＡＫＵＭＡＴꎬＮＩＳＨＩＫＡＷＡＡꎬＫＵＭＥＳꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＳｃｉＲｅｐꎬ２０１４ꎬ４:５４００.[２７]ＣＥＢＯＬＡＩ.Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９Ｖｅｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌꎬ２０２１ꎬ２３５１:３２１￣３３４. [２８]ＲＡＤＺＩＳＨＥＵＳＫＡＹＡＡꎬＳＨＬＹＵＥＶＡＤꎬＭＵＬＬＥＲＩꎬｅｔａｌ.Ｏｐｔｉ￣ｍｉｚｉｎｇｓｇＲＮＡｐｏｓｉｔｉｏｎｍａｒｋｅｄｌｙｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＣＲＩＳＰＲ/ｄＣａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓꎬ２０１６ꎬ４４(１８):ｅ１４１.[２９]ＬＡＭＭＴꎬＬＩＷꎬＲＯＳＥＮＦＥＬＤＭＧꎬｅｔａｌ.ＥｎｈａｎｃｅｒＲＮＡｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｍｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉꎬ２０１４ꎬ３９(４):１７０￣１８２.[３０]ＣＨＥＮＨꎬＤＵＧꎬＳＯＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｆｒｏｍｅｎ￣ｈａｎｃｅｒｓ:ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｅｎｈａｎｃｅｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１５(３):２０１￣２０７.[３１]ＮＯＪＩＭＡＴꎬＰＲＯＵＤＦＯＯＴＮＪ.ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＬｎｃＲＮＡｂｉｏｇｅｎｅ￣ｓｉｓａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｎａｓｃｅｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０２２ꎬ２３(６):３８９￣４０６.[３２]ＡＯＹＡＧＩＮꎬＷＡＳＳＡＲＭＡＮＤＡ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎａｌｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｄｒｏｓｏｐｈｉｌａＴＡＦ(Ⅱ)６０[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２００１ꎬ２１(２０):６８０８￣６８１９.[３３]ＤＡＮＩＮＯＹＭꎬＥＶＥＮＤꎬＩＤＥＳＥＳＤꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ:ａｔｔｈｅｈｅａｒｔｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａꎬ２０１５ꎬ１８４９(８):１１１６￣１１３１.[３４]ＢＵＴＬＥＲＪＥꎬＫＡＤＯＮＡＧＡＪＴ.ＴｈｅＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅⅡｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ:ａｋｅｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｅｓＤｅｖꎬ２００２ꎬ１６(２０):２５８３￣２５９２.(责任编辑:成纾寒)２４０１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第４期。

新产 品结 构 ，成功几 率可想而 知 ；而通 过收购各地 区 开 发市场的工作都是拜耳完成的 。
新 化合物 的方式 ，所 占研发途 径 的比例不多 。 因此 ，
国际农 化巨头研 发新产品所耗费的时 间较长 。 企业 与研 究单 位深度 合作
日本企业通 过 出售新化合物 的方法节约新农药创 制成本的 同时 ，先正达 、拜耳等农 化 巨头是该场 交易
Ｉ 埸 农 Ｉ 化
日本如何创制新农药
众所周知 ，新农药创 制过程难度 大、时间长 ，还需 在 此基础上开 发新 产 品，几率会 高很多。这一合作特 要投入 大量资 金 。先正 达、拜耳 等国 际农 化 巨头称 ， 点 也得 到 了上 海 农药 研 究所 教授 级 高工 张一 宾 的认
开发一 个新农 药需要投 人上亿美 元甚至更 多。而记者 同。他表 示 ， 日企 的新产 品研发 ，大都 是与农药合成 了解 到 ， 日本创 制费用远 低于 国际农化 巨头。很多 日 相 关的高校和研究所联 合进行 的，而高 校和研 究所的 本公 司如 日本 组合化学 、住友化学 和曹达 化学等 ，萁 新产 品研 究费用支 出 ，都是靠政府 的科研 项 目，多方 农药产 品的应 用效果也很 好 ，占据着 较大 的国 际市场 共 同承担研发费用 ，为企业节省 了部分 的研发费用 。 份额 。 日本每 年约有 ２ ０ ３ ０个新农药进行 登记 ， 日 ０— ０ 本企业 平均从 十万 个化合 物 中开 发一 个新化 合物 ，创 出售小试成功化合物 再有 ，新 化合物开 发出来后 ，有些产 品只进行实
深入研究作用机理
日本 农药企业 、相 关高校 和研究所对 新化合 物 的理论 们 并没有节 约研 发成本 。 研究 比较强 ，具有活性成分 的 资 媒 化 业 深 体 ８ｏ ／４ ５

仿制必然 要提 高粮食品质和单产 ， 农药的 使用 是不 。 叫缺少 国内外 知识产权保护力度逐步加大的今天 ， 的。 但我 国的农药工业是在仿制 国外品种的基础上发 要付 出高额 的专利 费， 这些费用最终将大大增加 农民
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的经济负担 ； 另外 ， 把农药控制权交给外 国． 存在很大
批发企业必须有一定比例的专业技术人员 ．零售企业
农药行业 的发展不能以牺牲环境为代价 ．更 不能
的销售人员也必须经过专 门培训 ，具备必要的农药使 允许以转移污染的方式维持农药行业 的利润 。应 该加 用知识。为此 ， 地方农业管理部门应对农药经销企业销 强环保要求 ， 严格执法 ， 避免单纯为谋求出口而出现 的 售人员进行免费培训 ， 考核合格后才能从事农药销售。 污染转移问题。口
农药 技术创新 工作成 效显 著。 比如沈 阳化 工研 究 院
不安全 因素 ， 果一旦 国外停 止供药或 供药不及 时 。 国 开 发 成 功 的氟 吗啉 从 ２ ０ 如 我 ０ １年 至 今 累计 销 售 １ ０ ２ ６ ０万
利税 ３５ ０万 元 ， 广 使用 １４ ０万 亩 次 ， 目前 国 ４ 推 ６ 是 农业就可能遭 受毁灭性打击 ； 有 。 还 如果 等国外 新品种过 元 ，
行严格监督检查，对于使用国家明令禁止的落后技术 药工业技术进步和 强化管理 ， 同时也使 出口面临挑战。 工艺的． 应责令立即停止使用： 产品质量不达标禁止出 近几年来 ， 中国在履约农药程序方面做了大量工作。其 厂； 达不到环保标准 的生产企业要坚决予以关闭。对于 中包括 ： 完善法律法规 ， 通过立法确保公约中农药程序 生产和产品质量 问题造成严重后果的案件 ．要追究有 的实施： 采取有效措施 ． 切实履行 公约所规定 的国际义

农药创制进展
HNPC-A9092、HNPC-A8169
属芳氧苯氧丙酸衍生物 室内和温室活性试验表明，两个化合物在15～45 g ai/hm2 剂量下能有效防治马唐、狗尾、稗草等重要单子叶杂草， 优于炔草酯 对阔叶作物茎叶及土壤处理均具有很好的安全性，可用于 小麦和阔叶作物田防治单子叶杂草 已获中国发明专利
农药创制进展
H-0909
2-氰基丙烯酸酯类化合物，一类特殊的PSII电子传递抑制 剂
室内生测表明，该化合物在1-3克/亩剂量下对苋菜、黄顶 菊、蒲公英、苦荬菜、马齿苋、苘麻和藜等的除草活性在 90-100% 作物安全性：16克/亩剂量下，对玉米安全
田间药效表明，该化合物对上述杂草也具有很高的活性 已申请中国发明专利
氯氟醚菊酯
农药创制进展
SYP-12194
三酮类化合物，属HPPD抑制剂，作用机制比较新颖 室内生测试验表明，对阔叶杂草和禾本科杂草均有防效， 其中对阔叶杂草防效较高，在75g ai/hm2剂量下对苘麻的 防效为100%，对稗草、百日草、狗尾草均有85%以上的 防效，同剂量效果好于磺草酮，与甲基磺草酮相当 对杂草苗前、苗后均有效，苗后优于苗前 对玉米安全，其安全性与磺草酮和甲基磺草酮相当
• 减少因病虫草害发生造成的农业损失 • 规避一些农药品种的垄断和暴利，降低用
药成本，减轻农民负担
• 推广及应用前景广泛
农药创制发展展望
• “十二五”期间国家加大对农药创新工作的支持力 度
• 成立“农药产业技术创新战略联盟”
• 申报国家科技支撑计划重大项目“绿色生态农药 的研发与产业化” • 已通过科技部项目论证及财务评审
• 专项经费22072万元
农药创制发展展望

农药创制需要新的保护机制
洪峰
【期刊名称】《中国农药》
【年(卷),期】2016(012)007
【摘要】农药创制实际上是个老生常谈的话题,从远的说,在北魏的时候中国人就已经开始创造性地使用砒霜作为拌种剂,用来杀死害虫。

从近的讲,1990年在上海举办了第一届中日农药交流会,当时中日农药专家讨论的主要议题,也是如何找到新的前体化合物。

后来南方、北方两个农药创制中心的建立,也彰显了政府部门对农药创制的决心。

只不过这些年过去了,我们在农药创制方面走的并不远。

【总页数】2页(P46-47)
【作者】洪峰
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S482
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2.新的时代需要与时俱进新的实践需要新的理论 [J], 黄建国
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4.我国藏区非物质文化遗产民事保护机制探析(中)--建立民事保护机制需要厘清的几个问题 [J], 吕彩霞;邹玉
5.组合化学与新医药新农药创制 [J], 刘佳;汤雨庭;李耀东
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新型杀虫剂实现产业化
佚名
【期刊名称】《农村百事通》
【年(卷),期】2001(000)012
【摘要】@@ 由西北农林科技大学 (邮编： 712100)吴文君教授主持研制的 " 新型植物杀虫剂棗 0.2％苦皮藤素乳油 " ，近日通过陕西省科技厅主持的成果鉴定，并已实现产业化。

【总页数】1页(P15)
【正文语种】中文
【中图分类】F3
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1.发挥客家祖地优势实现宁化客家小吃产业化——宁化客家小吃产业化路径探究[J], 罗华琛
2.“光叶楮速生丰产林产业化”战略联盟在武汉签字：打响了我国造纸工业光叶楮林纸结合实现规模化产业化生产的第一炮 [J], 聂勋载;
3.林业产业化是实现林业发展方式转变的最佳选择——论昔阳县林业产业化的实现路径 [J], 王建军
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