农杆菌介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化及插入突变体的筛选_张俊祥

苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果的研究的
开题报告
一、选题背景
苹果炭疽病是苹果主要病害之一，严重影响苹果产量和品质。

传统
的防治方法主要是化学农药喷洒，但长期积累会导致环境污染和抗药性
增强。

因此，寻找更安全、绿色的防治方法是当前亟待解决的问题之一。

其中，利用低毒性菌株来控制病害受到了广泛关注。

二、研究目的
本研究旨在筛选出苹果炭疽菌低毒性菌株，并探究其控病效果，为
苹果炭疽病的绿色防治提供理论依据和技术支持。

三、研究内容
本研究拟采用以下步骤：
1.从苹果炭疽病病灶样本中分离纯化炭疽病菌株；
2.筛选出苹果炭疽菌低毒性菌株，利用化学品敏感性测定和荧光素
酶标记技术进行鉴定；
3.探究低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果，通过田间小区试验和
播种育苗试验等方法评价其防治效果；
4.研究低毒性菌株防治苹果炭疽病的机制，通过测定其对苹果树生长、叶绿素含量、抗氧化酶活性等指标的影响，探究其生物学特性；
5.探究低毒性菌株对苹果果实品质的影响，通过评价果实品质相关
指标，探究其对果实品质的影响。

四、研究预期成果
本研究预期可以筛选出具有低毒性的苹果炭疽菌菌株，并初步探究其防治病害的机制。

同时，本研究还能为苹果炭疽病的绿色防治提供一种新的思路和技术支持。

五、研究意义
随着人们对食品质量和健康安全的要求不断提高，传统的化学农药防治方法日益受到质疑，因此绿色防治成为了农业生产发展的趋势。

本研究探究低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果，具有重要的理论和实践意义，为绿色防治提供了一种新的思路和技术支持。

专利名称：农杆菌介导的大型番茄的转化方法专利类型：发明专利
发明人：王宁宁,崔孟祥
申请号：CN200610130675.3
申请日：20061229
公开号：CN1995359A
公开日：
20070711
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用农杆菌介导的对大型番茄进行基因转化的方法。

该发明以子叶作为外植体，通过农杆菌介导的方法进行番茄转化，适用于各种大型番茄，具有较高的转化效率。

该方法很好地克服了以往大型番茄转化中容易出现的外植体易褐化，生芽率低，生根难以及移土成活率低等缺点，为以大型番茄为材料的分子生物学研究和利用基因工程技术进行优质新品种培育提供了有力的工具。

申请人：南开大学
地址：300074 天津市南开区卫津路94号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：廖晓荣
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苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究黄定宣;胡杨;孙光超;高小宁;尹志远;黄丽丽【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(042)007【摘要】[目的]筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料.[方法]从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增.[结果]大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87％的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95％)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69％)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1％的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失.通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体.[结论]获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础.【总页数】9页(P113-121)【作者】黄定宣;胡杨;孙光超;高小宁;尹志远;黄丽丽【作者单位】西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植物保护学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S436.611.1+1【相关文献】1.棉花黄萎病菌 T-DNA插入突变体库的构建及致病缺陷突变体筛选 [J], 谷素静;汪敏;桑茜;赵静;李洪连2.苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体的筛选及Vmzfp3基因的功能分析 [J], 李婷;吴玉星;曹克强;王树桐;黄丽丽;冯浩3.稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选 [J], 贺春萍;林春花;廖奇亨;李锐;郑服丛4.油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)T-DNA插入突变体表型特征分析 [J], 史志丹; 宋培玲; 郝丽芬; 皇甫海燕; 燕孟娇; 杨永青; 吴晶; 赵丽丽; 李子钦5.葡萄炭疽病菌T-DNA插入突变体的表型及致病性变异分析 [J], 张俊祥;吴建圆;冀志蕊;迟福梅;徐成楠;周宗山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

苹果炭疽叶枯病菌对3种杀菌剂的敏感性分析王美玉;冀志蕊;王娜;迟福梅;周宗山;张俊祥【期刊名称】《果树学报》【年(卷),期】2018(35)4【摘要】【目的】了解我国苹果主产区苹果炭疽叶枯病菌(Colletotrichum gloeosporioides)对苯并咪唑类、甾醇脱甲基抑制剂类和咪唑类杀菌剂敏感性的现状,旨为苹果炭疽叶枯病的科学防治提供参考,以及为苹果炭疽叶枯病菌抗药分子机制研究提供理论依据。

【方法】采用区分剂量法和菌丝生长速率法,对采自于我国苹果主产区的117个苹果炭疽叶枯病菌菌株进行甲基硫菌灵、戊唑醇、咪鲜胺的敏感性测定,并对随机抽测的28个菌株的β-微管蛋白基因(β-tubulin)进行序列分析。

【结果】117个供试菌株对甲基硫菌灵的抗药性频率为100%,均为高水平抗性菌株(HR)。

随机抽测24个菌株的β-tubulin基因,其中23个菌株的β-tubulin蛋白第198位氨基酸从谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala),另外1个菌株ZG4-7的第200位氨基酸从苯丙氨酸(Phe)突变成酪氨酸(Tyr)。

苹果炭疽叶枯病菌对戊唑醇的敏感性检测结果表明,戊唑醇对供试菌株的EC_(50)值(ρ,后同)为0~0.843 0 mg·L^(-1),平均EC_(50)值为0.155 5 mg·L^(-1),75.21%的菌株对戊唑醇表现出低水平抗药性,设置质量浓度为5 mg·L^(-1)时,对供试群体的平均抑制率为92.72%。

苹果炭疽叶枯病菌供试群体对咪鲜胺的敏感性较强,平均EC_(50)值为0.011 9 mg·L^(-1),设置质量浓度为0.5 mg·L^(-1)时,咪鲜胺对供试群体的平均抑制率为95.02%。

【结论】苹果炭疽叶枯病菌对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵表现出高抗性;对DMIs类杀菌剂戊唑醇表现出低水平抗性,但已产生高水平抗性菌株;对咪唑类药剂咪鲜胺敏感性较强。

专利名称：一种根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法专利类型：发明专利
发明人：蔡永萍,焦小雨,李国庆,王燕,金青,聂凡,林毅
申请号：CN201810036306.0
申请日：20180115
公开号：CN108004262A
公开日：
20180508
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种利用根癌农杆菌介导的平菇菌丝遗传转化方法，属于基因的遗传转化技术领域，包括以下步骤：1)质粒载体改造；2)改造后的质粒载体转化农杆菌，获得阳性菌；3)阳性菌侵染平菇菌丝，共培养得新长出的菌丝；4)将所述新长出的菌丝接种到含有潮霉素和头孢霉素的PDA 培养基上选择培养5～7d，分离得到有抗生素抗性的平菇转化菌株；5)对所述平菇转化菌株进行转基因鉴定。

本发明方法适用于平菇基因功能的验证及遗传改良育种等研究，具有操作简单、稳定性强、转化率高、成本低廉等优点。

申请人：安徽农业大学
地址：230000 安徽省合肥市长江西路130号
国籍：CN
代理机构：北京高沃律师事务所
代理人：刘奇
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炭疽叶枯病菌诱导的不同苹果种质中防御酶活性及丙二醛含量比较孔祥华;侯董亮;张伟;田义轲;刘源霞;王彩虹【期刊名称】《青岛农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(034)001【摘要】以苹果品种‘秦冠’、‘富士’及二者的杂交种‘QF-2’为试材,室内接种炭疽叶枯病菌,发现前者表现为感病,后二者均表现为抗病.接种后的0~4 d内,寄主叶片内的SOD、POD、CAT活性均出现先升高后降低的趋势,在接种1 d后出现峰值,且在抗病种质上明显高于感病种质.PPO活性在接种后也是呈现先上升后下降的趋势,但感病种质'秦冠'的上升速度较快,峰值出现较早.对三份种质来说,受病原菌的诱导,MDA含量均在接种1 d后达到高峰,然后缓慢下降,但其含量变化与种质间的抗性水平差异没有明显的相关性.【总页数】4页(P5-8)【作者】孔祥华;侯董亮;张伟;田义轲;刘源霞;王彩虹【作者单位】青岛农业大学园艺学院,山东青岛 266109;青岛农业大学园艺学院,山东青岛 266109;青岛农业大学园艺学院,山东青岛 266109;青岛农业大学园艺学院,山东青岛 266109;青岛农业大学园艺学院,山东青岛 266109;青岛农业大学园艺学院,山东青岛 266109【正文语种】中文【中图分类】S661.1【相关文献】1.9种生物源杀菌剂对苹果炭疽叶枯病菌的室内活性评价 [J], 常翠莲;渠非;冯浩;黄丽丽2.6种杀菌剂对苹果炭疽叶枯病菌的室内活性评价 [J], 刘召阳;胡建邦;黄丽丽;冯浩3.解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用 [J], 朱娜;张树武;徐秉良;刘佳4.接种苹果炭疽叶枯病菌对苹果叶片相关酶活性及基因表达的影响 [J], 刘瑛双;房中文;TURAKULOV Kh S;刘春晓;董超华;张玉刚5.N、P、K元素对苹果炭疽叶枯病菌的影响 [J], 谭子祎;张华;辛海波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

浙江大学硕士学位论文农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选姓名：刘朋娟申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王政逸20050501本研究受国家自然科学基金项目３０２７０８６１资助单位代码：——究生学号：——硕士学位论文农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选论文评阅人：．郄鏖压潘废垡蒸友基答辩委员会主席：．郑康乐答辩委员会成员：奎蕉夔筮回盐国昌三遮逸论文答辩日期：摘要稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）可以引起水稻上的重要病害一稻瘟病。

了解彪ｇｒｉｓｅａ的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义，而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。

分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因，是达到这一目标的关键所在。

ＢＮＡ插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一，ＡＴＭＴ是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术，具有转化效率离、成本低，操作方便和重复性好多重优点。

我们在构建了二个含有潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因双元载体的基础上，成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化，转化效率达每１０６个分生孢子＞３００个转化子，并得到了４０００多个转化子。

通过继代培养和ＰＣＲ检测，证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明，大约有２／３转化子的Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。

用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性，发现一个致病缺陷突变体：Ａ１－４１２。

该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片，说明Ａ１．４１２突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。

进一步的表型分析，发现Ａ１，４１２突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的７％，在疏水表面不能形成附着胞，部分分生孢子萌发的速度也略有延迟。

Ｓｏｕｔｈｃｍ杂交显示Ａ１－４１２基因组中Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。

苹果采后炭疽病高效拮抗菌的筛选与应用
刘淑芳;檀根甲;李娜;侯晓丹;李增智
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2007(34)1
【摘要】利用低能氮离子对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行注入诱变,获得诱变菌株。

通过平板初筛,筛选出6株对苹果炭疽病菌有较高抑菌作用的菌株,经苹果果实活体测定从中筛选出对苹果炭疽病有较高拮抗作用的菌株BS 80-6和BS100-6。

其中BS80-6在室温下的防治效果较好,14 d时的防效为33.28%,BS100-6在冷藏下的效果较好,14 d时的防效为100%。

不同接种方式试验表明,拮抗菌对苹果炭疽病表现出较好的保护作用。

【总页数】6页(P111-116)
【关键词】离子注入;枯草芽孢杆菌;生物防治;拮抗菌
【作者】刘淑芳;檀根甲;李娜;侯晓丹;李增智
【作者单位】安徽农业大学植物保护学院
【正文语种】中文
【中图分类】S436.611
【相关文献】
1.苹果炭疽病拮抗菌的筛选及其分离 [J], 王亮
2.红树内生细菌菌株Kc-38的抗菌物质及对采后芒果炭疽病的防效 [J], 汪远;詹儒林;何红;吕柱彬;余小琴;梁永琪;陈鸿宇
3.采后番木瓜果实炭疽病病原菌分离鉴定及其拮抗菌的筛选 [J], 王雅君; 邵远志; 何文琪; 尤文静; 葛春晖; 李雯
4.苹果采后病害拮抗菌的筛选及鉴定 [J], 马瑜;李勃;田稼;孙超
5.根茎和草药提取物对火龙果采后炭疽病的抗菌作用及其可能的植物毒性 [J], 周洲(摘译)
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农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选毕方铖;戴宏芬;孟祥春【摘要】构建含潮霉素抗性基因和 GFP 基因的双元载体 pCAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌 EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌 Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和 GFP 荧光来筛选阳性转化子。

然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。

结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和 GFP 荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。

随机挑选其中13个突变体进行 PCR 检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。

%The recombinant vector pCAMBgfp, containing hygromycin resistant gene and gfp reporter gene, was constructed and transformed into mango Colletotrichum gloeosporioides via Agrobacterium tumefaciens EHA105. Positive transformants were identified by both resistant to hygromycin and green fluorescence observation. Transformants defective in pathogenicity were screened out through inoculation assay on detached mango leave and fruit. Total 500 positive transformants were screened out from several transformation. The average transformation efficiency was up to 400 transformants per 106 conidia. All of the transformants tested remained stable in hygromycin resistant and gfp fluorescence after several generations of growth in the media absence of hygromycin. 13 candidate mutants were randomlyselected for PCR detection of the gfp gene and 8 mutants shown pathogenicity reduction or lose.【期刊名称】《热带农业科学》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】5页(P47-51)【关键词】胶孢炭疽菌;遗传转化;突变体;致病性【作者】毕方铖;戴宏芬;孟祥春【作者单位】广东省农业科学院果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室广东广州 510640;广东省农业科学院果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室广东广州 510640;广东省农业科学院果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】S432.44炭疽病菌(Colletotrichum spp.)是世界分子植物病理学研究中十大病原真菌之一，该病菌严重危害重要的经济作物，特别是水果，蔬菜及观赏植物[1]。

一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化
体系的构建方法
炭疽菌是一种严重危害农作物的病原菌，针对炭疽菌的研究已经成为植物病理
学领域的热点。

为了研究炭疽菌的生物学特性和进行进一步的遗传改良，开发了一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。

首先，炭疽菌原生质体的制备方法是通过对炭疽菌菌丝体进行处理得到。

具体
步骤如下：首先，将炭疽菌菌丝体培养在含有适宜培养基的琼脂平板上。

然后，收获培养的菌丝体并将其转移到含有适宜培养基的液体培养基中进行预培养。

接下来，添加适当的酶溶解液对菌丝体进行酶解，以释放出原生质体。

最后，通过离心或过滤等方法去除残余的菌丝和细胞碎片，得到纯净的炭疽菌原生质体。

随后，通过构建遗传转化体系，可以实现对炭疽菌的遗传改良和功能基因研究。

构建遗传转化体系的方法如下：首先，选择合适的质粒载体，该载体应包含所需的转录子序列、选择标记基因等。

然后，将质粒载体与炭疽菌原生质体共转化。

可以使用电穿孔、化学转化或基因枪等方法实现质粒载体与原生质体的转化。

接下来，将转化后的炭疽菌原生质体进行培养和筛选，以获得转化率较高的遗传转化体。

这种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法能够为炭疽菌的研
究提供基础工具和平台。

通过这些方法，研究人员可以更好地理解炭疽菌的生物学特性，进一步探索其致病机理，并开展炭疽菌抗病性育种和基因功能研究等方面的工作。