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用Trizol 法提取RNA

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精品文档 用Trizol 法提取RNA

什么是Trizol？Trizol 是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出核酸酶。

由于RNA酶无处不在和其难以灭活的顽固本性，RNA的抽提环境应严格控制，所用试剂耗材均应是RNase-free或经过DEPC处理过的，具体的注意事项可参见上一篇文章《分子狗，你还在谈qRT-PCR色变吗？》。

接下来我们着重从实验步骤的各个阶段进行剖析：

一，样品准备

①从组织中提取总RNA

液氮研磨，将组织块放入研钵中，加入少量液氮，迅速使用研杵研磨，期间不断加入液氮，直到组织研磨成粉末状。每50-100 mg组织加入 1 ml Trizol，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。

匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10%，用匀浆器充分匀浆，直到无明显颗粒，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。

②从细胞中提取总RNA

贴壁细胞，去除培养基，用适量无菌PBS清洗细胞表面，加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。 资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢

精品文档 悬浮细胞，收集细胞悬液，1000×g离心5 min，弃培养基；用适量无菌PBS清洗细胞，1000×g离心5 min弃上清，沉淀加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。

③从细菌中提取总RNA

对于细菌或蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高的样品，需要额外的分离步骤。加入Trizol吹打混匀后，4℃，12000×g，离心10 min。将上清转移至新的RNase-free的离心管中，存在-80℃冰箱备用。

二，RNA提取

①将冻存的RNA样本从-80℃冰箱取出置于冰上解冻。

② 于每管样本中加入200 µl RNA专用的三氯甲烷(每毫升Trizol加200 µl)，置于振荡器震荡1 min，冰上静置5 min。

③4℃，12000×g，离心10 min。

④ 此时液体分三层，将上层的水相转移到另一个RNase-free的离心管中。

⑤加入等体积的-20℃预冷的RNA专用的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃静置15 min以上。

注：增加-20℃的静置时间会增加RNA尤其是miRNA的得率。

⑥4℃，12000×g，离心15 min，小心弃上清。

⑦加入1 ml预冷的75%的乙醇（25% DEPC无菌水，75% RNA专用无水乙醇）涡旋混匀。 资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢

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⑧4℃，7500×g，离心10 min，尽量去除离心管中的残液，然后在无菌操作台中风干约10 min（注意不要过度干燥，否则难以溶解）。

⑨每个离心管中加入适量的RNase-free的ddH2O溶解沉淀，用枪头吸打混匀，至完全溶解。离心几秒，让离心管中的液体全部在管底，然后置于冰上。

⑩去除杂质DNA：

a在RNase-free的离心管中配制以下去除RNA中DNA的体系反应液：

Reagent Volume

Total RNA 10 µg

10×DNaseI buffer(Mg2+) 5 µl

DNaseI (1U/µl) 10 µl

RNase Inhibitor（40U/µl） 0.5 µl

DEPC-treated water up to

50 µl

b 加入25 µl 50 µM的EDTA，65℃反应10 min。

c 用RNase-free的ddH2O定容到100 µl。

d 加入10 µl 3M NaAc和250 µl冷乙醇，混匀后-80℃放置30 min以上。

e 4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清。

f 加入75%的冷乙醇，4℃ 12000 rpm离心10 min，尽量弃上清。

g 打开EP管盖子，在操作台中风干约10 min。 资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢

精品文档 h 用适量的RNase-free的ddH2O溶解后，使用Nanodrop-2000测RNA的浓度。

琼脂糖电泳检测RNA的完整性：建议使用DEPC处理的ddH2O配置1.2%琼脂糖凝胶，DEPC处理的ddH2O稀释TAE缓冲液。

*完整的RNA经凝胶电泳后会明显地观察到28S和18S两条带，并且28S的条带亮度约是18S的两倍。若两条条带不明显，则提示RNA可能部分降解。

*提取的RNA可用于后续操作，如需用qRT-PCR检测基因表达，为避免RNA降解，建议提完RNA后立即将RNA逆转录成cDNA进行保存，cDNA可在-20℃长期保存。

常见问题及解决办法

RNA的各种吸光度代表什么？

260 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.2之间。当R＜1.8时，说明溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R＞2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。

RNA提取量低怎么办？

① 加大起始的样本量。

② 向组织或细胞中加入Trizol之后，充分吹吸使样本充分裂解。

③ 加入三氯甲烷分层后，尽量完全回收上清。

提取的RNA不溶怎么办？

① 75%乙醇清洗沉淀后干燥时间不要过长。 资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢

精品文档 ② 可以于60℃加热5 min后再冰上溶解数小时。

③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清时，避免枪头接触蛋白层。

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trizol法提取rna的原理

trizol法提取rna的原理

trizol法提取rna的原理

Trizol法是一种常用的RNA提取方法，它是一种单步法，可以同时提取RNA、DNA和蛋白质。该方法基于酚和胍的化学性质，通过酚的溶解性和胍的离子性来分离RNA、DNA和蛋白质。

Trizol法的原理是利用酚的溶解性质将细胞膜和细胞核膜破坏，使RNA、DNA和蛋白质释放出来。然后，加入氯仿，使RNA、DNA和蛋白质分为两个相，RNA在上层，DNA和蛋白质在下层。接着，加入异丙醇，使RNA从上层转移到异丙醇层中，形成RNA沉淀。最后，将RNA沉淀用乙醇洗涤，去除杂质，得到纯净的RNA。

Trizol法的优点是简单、快速、高效，可以同时提取RNA、DNA和蛋白质，适用于多种样品类型，如细胞、组织、血液、尿液等。此外，该方法提取的RNA质量好，适用于后续的实验操作，如RT-PCR、Northern blot、RNA测序等。

但是，Trizol法也存在一些缺点。首先，该方法对RNA的长度和结构有一定的限制，不适用于长链RNA和某些结构特殊的RNA。其次，该方法对样品的处理和操作技巧要求较高，容易受到外界因素的影响，如温度、湿度、pH值等。最后，该方法的成本较高，需要使用较多的试剂和设备。

Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用酚和胍的化学性质分离RNA、DNA和蛋白质。该方法具有简单、快速、高效等优点，但也存在一些缺点。在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的RNA提取方法。

trizol提rna方法

trizol提rna方法

trizol提rna方法

TRIzol提RNA方法简介

TRIzol提RNA方法是一种常用的RNA提取方法，采用TRIzol试剂将RNA稳定在总RNA样品中提取出来，通过分离纯化使RNA的质量和完整性得到一定保证。TRIzol提RNA方法具有以下特点：

1. 适用范围广

TRIzol提RNA方法不仅适用于多种类型的样品，如细胞、组织和微生物等，还可用于分离多种类型的RNA分子，如mRNA、rRNA和miRNA等。

2. 提高RNA的纯度和质量

TRIzol试剂具有独特的成分，可以最大限度地去除DNA、蛋白质等干扰物质，提高RNA的纯度和质量。同时，TRIzol提RNA方法还可以避免RNA的降解和失活，保证RNA完整性。

3. 操作简单、快速

TRIzol提RNA方法操作简单，一般可以在1-2小时内完成RNA提取。相对于其他RNA提取方法，TRIzol提RNA方法快速、高效。

TRIzol提RNA方法步骤

TRIzol提RNA方法共分为以下步骤：

1. 样品裂解

将样品加入TRIzol试剂中，裂解细胞并溶解RNA。

2. 相分离

将样品和TRIzol混合液沉淀，然后加入一个有机溶剂，使RNA与水相分离。

3. 提取RNA

将RNA上清液收集起来，加入氯仿，进一步去除有机溶剂和DNA。

4. 沉淀RNA

将RNA上清液沉淀，将RNA稳定在沉淀中，去除残留的有机溶剂和盐分。

5. 溶解RNA

将RNA沉淀中的RNase-free水添加至RNA沉淀中，彻底溶解RNA。

如何提高TRIzol提RNA质量和完整性

1. 样品处理

不同类型的样品有不同的处理方式。对于细胞和组织等样品，应尽量在收集后尽快进行TRIzol提RNA操作，避免RNA在细胞或组织中降解和失活。

2. TRIzol试剂的使用

使用新鲜的TRIzol试剂，并根据使用说明操作。避免直接接触试剂和皮肤等。

3. RNA逆转录和扩增

在进行RNA逆转录和扩增前，应对RNA质量和完整性进行检测，以确保数据准确性。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizoｌ法使用步骤

一、分离纯化得基本原理

研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。

二、用户需自备得试剂与材料

无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)

三、准备工作

RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。

RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。

1、 料制品得处理

尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下:

1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。注意:DEPＣ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。

2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。

3)在通风柜中室温处理过夜。

4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已ＤEＰＣ水处理过得塑料制品得

烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适得温度烘拷至干燥。置于干净处备用。

Trizol提取总RNA-碧云天改进

Trizol提取总RNA-碧云天改进

Trizol 法提取RNA实验步骤

1. 细胞裂解或组织匀浆。

a. 贴壁细胞

吸尽培养液，每10平方厘米细胞加入1ml Trizol。一般六孔板每孔加1ml Trizol，

12孔板每孔加0.5ml Trizol。晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。

b. 悬浮细胞

离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1ml Trizol。用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。

c. 组织

先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50mg-80mg组织加入1ml

Trizol，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入Trizol进行总RNA抽提。

2. 对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织， Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12,000g 4℃离心10分钟，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。

3. 室温放置5分钟，使样品充分裂解。

4. 每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿， vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。

5. 12,000g 4℃离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml。

6. 按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。如果希望提取microRNA等小RNA，推荐-70℃沉淀过夜。

7. 12,000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。

8. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)， vortex或颠倒混匀，

9. 7,500g 4℃离心5分钟，弃上清。再用快速离心机甩一下，小心吸尽液体。

10. 待5-10分钟RNA略干后，加入20μlDEPC水溶解， -70℃冻存。注意：切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。