农杆菌感受态制备

农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中,250 r/min，26-28℃悬浮培养12—16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min，离心8 min；⑥弃上清,加入原始菌液1/50体积（800μl/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μl）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀,冰上放置30 min;②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中,待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板)；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。

以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1。

版本一 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl （7.0） 0.01 DTT）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。

农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。

说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。

今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。

要准备的就是农杆菌的培养。

想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。

选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。

然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。

温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。

要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。

就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。

等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。

这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。

取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。

用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。

这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。

可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。

想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。

然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。

这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。

把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。

期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。

就要进行转化了。

这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。

把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。

静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。

农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转化
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min
2．37℃热激5min
3. 加1mlLB，28℃培养3-4h
3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干
农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。

（GV3101）
庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解
200ml LB + 200ul母液
农杆菌转植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）
每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。

不得低于0.7.
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。

一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。

三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。

20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。

农杆菌感受态细胞的制备实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl 2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。

［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；4、加入1000μl 20mM CaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500μl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。

农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。

注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。

挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。

第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。

注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。

第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。

注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。

摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。

4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。

6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。

7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。

注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。

8) 4℃，5000rpm 离心5min 。

9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。

10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。

注意：要用1ml 枪轻轻抽打。

11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。

版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。

1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。

再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。

28 C培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。

5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。