枳实

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枳实中有效成份检测方法文献综述

【摘要】:本文主要介绍了枳实的三类有效成分辛弗林、黄酮类及挥发油类物质的含量测定方法,辛弗林用高效液相色谱法及毛细管电泳法均可取的较好的结果,黄酮类化合物也可以用毛细管电泳法测定,但最佳方法及最佳条件仍有待于研究。GC-MS则是测定挥发油含量最佳的方法。

【关键词】: 枳实 有效成分 含量测定

枳实为芸香科植物酸橙酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus

sinensis Osbeck的干燥幼果。具有破气消积,化痰散痞之效[1]。其化学成分主要有辛弗林(synephrine) ,N一甲基酪胺(N-methyltyramine)等生物碱类,新橙皮苷(neohesperidin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)、芸香柚皮苷(narirutin)等黄酮类,另外还含有柠檬(limonene)等挥发油类成分。其中辛弗林是间接β-肾上腺素激动剂,它具有强心、增加心输出最、改善心泵血功能及提高外周阻力、升高血压的作用[2-3];黄酮类成分具有抗炎、抗氧化、清除自由基和抗过敏等药理作用[4-5]。挥发油类成分具有镇痛、止咳、祛痰、抗菌及中枢抑制的作用[6-7]。

枳实的药用历史悠久,始载于《神农本草经》。时至今日,其应用广泛,仍有较高的药学价值。生物碱类辛弗林、黄酮类及挥发油类物质是其主要的药用活性成分。为提高药用效果、减少毒副作用、建立更为完善的质量标准,对于各种有效成分的鉴别及含量测定就显得尤为关键。本文主要介绍的就是各成分的鉴别及含量测定的方法。

1 辛弗林含量测定

1.1 薄层扫描法:

王国荣等[8]采用薄层扫描法测定酸橙积实(壳)中辛弗林和N-甲基酪胺的含量。实验条件如下:采用硅胶G薄层板;展开剂为氯仿-甲醇-甲酸-水(6:2:1.4:0. 1) ;显色剂为0.2%茚三酮溶液;扫描波长λS= 510nm, λR=700nm,在此条件下,辛弗林在0. 4~4μg范围内呈良好的线性关系,显色斑点在60min内稳定,RSD= 0.9%,该方法的回收率为98. 06%。

1.2 高效液相色谱法:

许妍、付辉政[9]采用RP-HPLC法测定枳实中辛弗林的含量。实验条件如下: 色谱柱:hypersil C18色谱柱(125×4.6mm,5um) ;流动相:甲醇-水(1000m1中加入磷酸二氢钾0.6g,十二烷基磺酸钠1.0 g,冰醋酸1m1)(50:50);流速:1ml/min;检测波长:275nm;柱温:25℃。结果:辛弗林在0.0624~0.624 ug范围内呈良好的线性关系((r=1).平均回收率和RSD分别为98.748%和1.1%。

1.3 毛细管电泳法:

彭友元、叶建农[10]曾用毛细管电化学检测法来测定中药枳实中辛氟林的含量。最佳条件为以300um直径的碳圆盘电极为检测电极,检测电位为+0.85 V (vs.SCE),分离电压12kv,进样时间6 s,在80mmo1/L硼酸盐(PH=8.45)的运行缓冲液中,被测物浓度在0.2~200mg/L范围内呈良好线性,检出限(S/N=3)在为5×10-5g/L,该法简单、可靠、快速,单次测定可在20min内完成,已经成功应用于实际样品的含量测定。

施桂英等[11]采用毛细管电泳-化学发光法来测定枳实中辛弗林含量,根据酸性高锰酸钾氧化有机物产生化学发光为原理,采用自主装的CE-CL接口,将具有高分离效率的CE与高灵敏度的CL结合起来,建立一种简单快速测定积实中辛弗林的CE-CL法。以pH=8.3的60mmo1/L Na2B4O7-NaH2PO4缓冲液(含30%甲醇)为运行缓冲液,辛弗林在8min内出峰且峰型良好,线性范围为5.0-30ug/ml,检出限为1.4ug/ml,取得了较为理想的效果。

1.4 超临界流体色谱法:

陆晓峰等[12]采用填充柱超临界流体色谱法测定枳实中辛弗林的含量。实验条件如下:色谱柱:Berger PYR(乙基吡啶柱,250mm x 4.6mm, 6um,流动相:超临界CO2-0.2%异丙胺甲醇( 77:23 ),压力:100bar,温度:350℃,流速:2.0mL/min,检测波长:225nm。结果:辛弗林在0.71~11. 36ug范围内呈良好的线性关系,r= 0.9998,平均加样回收率为99.

57%,RSD=1.69%。

2 黄酮类化合物含量测定

2.1 薄量层扫描法

王跃生,罗文毓[13]曾用薄层扫描法测定枳实中总黄酮的含。实验条件为:硅胶G薄层板;展开剂为乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(15:2:1);检测条件:UV 254nm,UV 365nm下观察;定量:CS-920薄层扫描仪定量。检测结果:在8~40ug范围内呈良好线性关系,平均回收率为99.41%。

2.2 高效液相色谱法

刘振丽等[14]在枳实饮片中三类化学成分含量测定就是用高效液相色谱法测定黄酮类成分橙皮苷和柚皮苷。实验条件为:Zobax-C18色谱柱(4.6mm x 150mm, 5um),流动相甲醇-2%醋酸(30: 70);流速1.0mL·m in-1;检测波长285nm;柱温30℃。结果表明柚皮苷在0.16~1.44ug(r=0.9998)具有良好的线性关系。

2.3 毛细管电泳法

刘海兴[15]曾用毛细管区带电泳法测定中药枳实中柚皮素的含量。他使用的是CL

1030高效毛细管电泳仪(75um)内经,60cm总长)。电泳条件为: 30mmol/L Na2Ba4O7缓冲溶液运行电压为20 kV,紫外检测波长为254nm,实验温度为18℃,重力进样时间为8 s(7.5cm高度差)。测得的积实中抽皮素的含量为:0. 5867mg/g RSD = 4. 12%。彭友元等[10]在运用毛细管电化学检测法测辛弗林含量时,同时测定了橙皮苷、柚皮苷和柚皮素三种黄酮类物质,其被测物浓度与峰电流在3个数量级范围内呈良好线性,检出限在1×10-4~5×10-4之间,检测结果较为令人满意。

3 挥发油类含量测定

因为挥发油的特殊性质,其含量测定一般都会用到气相色谱。潘馨[16]曾用气相色谱法测定绿衣枳实中β-蒎烯的含量。实验中所用仪器为:HP6890N气相色谱仪,HP-1石英弹性毛细管柱色谱柱(30 m × 0. 25 mm, × 0. 25 um)。程序升温:初始温度100 ℃,20 min后以3 ℃/min的速度升至140 ℃,保持7 min,再以7 ℃/min的速度升至220℃,并保持10 min。进样口温度250 ℃,检测器温度250 ℃。载气为氮气,FID检测器,分流30:1,进样量为l μl。

袁伟彬等[17]利用GC-MS对枳实的挥发油化学成分进行分析。实验条件:仪器:GCMS-QP5000 型气相色谱质谱联用仪( 日本岛津公司) 。色谱条件GC: DB-1MS 石英毛细管色谱柱( 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) ,进样口温度250 ℃,接口温度230 ℃,载气为氦气,流速1. 3 ml/min,柱压80 kPa,分流比为30∶1,进样量为1.0μL; 升温程序: 柱始温60℃,保持1 min,再以3 ℃ /min 的速率升到100 ℃,保持1 min,再以10 ℃ /min 的速率升到130 ℃,保持1 min,再以2 ℃ /min 的速率升到180 ℃,保持1 min,再以6 ℃ /min 的速率升到260℃,保持2 min 。MS: EI 源( 70 eV) ,双灯丝; 电离电压1. 0 kV,质量扫描范围m/z: 40 ~ 450,扫描间歇0. 5 s。结果:

鉴定出枳实挥发油成分中的19 个化合物,占所提取挥发油总量的95. 791%。主要成分为: 柠檬烯( 68. 25%)。

辛弗林和黄酮类化合物的含量测定方法中有许多可以通用的方法,薄层扫描法、高效液相色谱法及毛细管电泳法均适合这两种物质的检测,贾强等[18]曾用HPLC-ESI-MS分析枳实中的化学成分,得到了辛弗林及橙皮苷、柚皮苷等黄酮类的含量。彭友元等[10]运用毛细管电化学检测法测定了辛弗林、橙皮苷、柚皮苷和柚皮素三种黄酮类物质。随着仪器的更新与科技的进步,薄层色谱法逐渐被高效液相色谱法取代。HPLC有较高的重复性, 容易实现自动化, 但操作复杂、仪器昂贵, 且中药中的一些共存物质会污染或损坏色谱柱。薄层色谱法操作繁琐, 不利于快速分析。毛细管电泳法则进一步解决了相关问题,该法简单、可靠、快速单次测定可在20 min内完成。

近年来GC-MS以其高分辨率及高灵敏度在关挥发油成分及含量测定中占主导地位,廖凤霞等[19]用GC-MS对枳实挥发油成分分析鉴定出15种化合物,占挥发油总量93.81%。刘元艳等[20]对重庆枳实分析酸橙得到29种化合物,占挥发油总量97.7%,甜橙得到38种化合物,占挥发油总量99.07%。

综上所述,高效液相色谱法在测定枳实中辛弗林与黄酮类含量中仍有广泛的应用,检测结果与所用的色谱条件密切相关。而毛细管电泳法则显示出其方便,快捷的优势。对于辛弗林含量测定方法在2010版药典中已有论述,与许妍、付辉政等[9]所使用的色谱条件基本一致,但是黄酮类化合物含量测定的最佳方法及最佳条件仍有待于研究。GC-MS则无疑是测定挥发油含量最佳的方法。

参考文献:

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[8] 王国荣,章育中,胡队林.薄层扫描法测定酸橙积实(壳)中辛弗林和N-甲基胺的含量[J].药物分析杂志.1994, 14( 4) : 48~ 50.

[9] 许妍,付辉政.RP-HPLC法测定枳实中辛氟林的含量[J].药品评价.2005.2(6):436~437.