【CN110172451A】一种高通量分离噬菌体的方法【专利】

专利名称：一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法
专利类型：发明专利
发明人：赵月峨,周冬生,王鹏,殷喆,赵晓冬,胡凌飞,吴妮尔
申请号：CN202111322948.5
申请日：20211110
公开号：CN113782100B
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法。

该方法通过对细菌的若干菌株高通量测序数据进行分析和数据拼接，对其所包含的质粒进行鉴定和分型。

本发明可在短时间内对大量细菌测序数据进行分析，获得其中包含的质粒类型、耐药/毒力基因等。

本发明可作为传统实验室鉴定生物实验的有益补充，达到快速鉴定质粒的目的。

本发明具有重要的应用价值。

申请人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
地址：100850 北京市海淀区太平路27号院
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：闫书宁
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011084828.1(22)申请日 2020.10.12(71)申请人 上海市公共卫生临床中心地址 201508 上海市金山区漕廊公路2901号(72)发明人 朱同玉　赵运泽　陈立光　顾敬敏　程梦珺　吴楠楠　郭晓奎　郭明权　乐率　秦金红　(74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙) 31262代理人 周春洪(51)Int.Cl.C12N 7/02(2006.01)A61K 35/76(2015.01)A61P 31/04(2006.01)C12R 1/92(2006.01)(54)发明名称一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法及应用(57)摘要本发明涉及一种噬菌体制剂中内毒素(LPS)的去除方法及其应用，所述方法包括步骤：用氯仿杀菌、通过离心的方式去除噬菌体制剂中细菌碎片等杂质→活性剂TritonX ‑100将与噬菌体相结合的LPS解离，并使大分子LPS降解成小分子LPS →透析清除游离的小分子LPS →PEG8000浓缩提高噬菌体滴度及去除大分子LPS →氯仿去除引入的杂质→透析去除有机溶剂。

其优点表现在：(1)成本低，所用设备简单，常规实验室均能满足。

(2)在不影响噬菌体活性的基础上，实现去除噬菌体制剂中LPS含量至5EU/ml以下。

(3)回收后活性噬菌体滴度最高可达回收前的120％。

(4)对噬菌体或蛋白制剂的内毒素去除具有普遍适用性。

权利要求书1页 说明书10页 附图7页CN 112175915 A 2021.01.05C N 112175915A1.一种噬菌体制剂中内毒素的去除方法，其特征在于，包括步骤：(1)加入氯仿到噬菌体母液中裂解细菌释放全部噬菌体；(2)加入5％TritonX -100将与噬菌体制剂结合的LPS解离、将溶液中游离的大分子LPS 降解为小分子LPS；(3)透析去除溶液中游离的小分子LPS；(4)PEG8000浓缩去除大分子LPS和TritonX -100，提高噬菌体滴度；(5)加入氯仿去除残留的TritonX -100和PEG8000；(6)透析去除残留的杂质，获得超低内毒素水平的噬菌体制剂。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880022547.8(22)申请日 2018.03.27(30)优先权数据62/477,955 2017.03.28 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日2019.09.27(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2018/024425 2018.03.27(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/183229 EN 2018.10.04(71)申请人 孟山都技术公司地址 美国密苏里州(72)发明人 J ·R ·默里　B ·沃恩　(74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256代理人 孟凡宏　王月(51)Int.Cl.C12N 1/06(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称用于高通量基因组DNA提取的方法(57)摘要提供了从广泛的微生物中快速提取基因组DNA的新颖方法，以及用于这些方法的组合物。

本文提供的方法提供了从许多微生物样品中提取增加的浓度的gDNA，以及从较大量微生物物种或分离物中有效回收gDNA。

权利要求书2页 说明书14页 附图6页CN 110494550 A 2019.11.22C N 110494550A1.一种用于从微生物样品中提取基因组DNA(gDNA)的方法，所述方法包括以下步骤：a)使所述微生物样品经受机械破坏；b)使所述机械破坏的微生物样品与包含蛋白酶和糖苷水解酶的酶混合物接触以产生所述微生物样品的裂解物；以及c)从所述微生物样品的裂解物中纯化微生物gDNA。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述机械破坏包括使用珠粒。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述珠粒是石榴石珠粒、碳化物珠粒、金属珠粒、玻璃珠粒或陶瓷珠粒。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述珠粒的直径为0.1mm至3.0mm。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910506027.0(22)申请日 2019.06.12(71)申请人 湖南大学地址 410012 湖南省长沙市岳麓区麓山南路麓山门(72)发明人 彭绍亮　牛琦　童贻刚　张湘莉兰　李肯立　曲强　谢湘成　(74)专利代理机构 国防科技大学专利服务中心43202代理人 王文惠(51)Int.Cl.G16B 15/30(2019.01)G16B 20/30(2019.01)(54)发明名称一种基于高通量测序数据的溶源性噬菌体预测方法(57)摘要本发明属于生物信息学领域，公开了一种基于高通量测序数据的溶源性噬菌体预测方法，通过将原始测序数据和拼接后的细菌基因组数据相结合，先设计了质控过滤流水线对原始测序数据进行质控和过滤，再在拼接后的细菌基因组基因片段上根据类噬菌体基因聚类簇预测出粗略前噬菌体范围，接着在粗略范围上根据整合位点搜索出精确前噬菌体候选对象，最后从原始测序数据中挖掘环化信息，验证前噬菌体功能性并基于一致性延伸算法提取出对应的溶原性噬菌体全序。

本发明实现了对细菌基因组中的溶源性噬菌体的有效预测，具有十分重要的推广应用价值。

权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 110211628 A 2019.09.06C N 110211628A1.一种基于高通量测序数据的溶源性噬菌体预测方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步、开始对原始测序数据的质量值进行控制和过滤：为保证对基因组进行测序时的准确性，定义测序得到的每个碱基的质量值表示各个碱基的置信度的度量标准，表示此碱基测序错误的概率，质量值越高说明错误率越低，测序准确率就越高；如果测序质量值偏低，则会对拼接效果造成不良影响，因此必须对质量值进行过滤，去除质量值较差的序列；第二步、准备对高质量数据进行测序并组装：为方便测序，会人为地添加一种短片段，称为接头，最后的测序结果可能会残存接头序列，从而影响拼接的结果，因此需要人为地建立接头数据库，把测序数据中的碱基序列逐个与接头数据库中的序列进行比较，删除相同序列，完成对接头序列的过滤，得到净化后的数据进行拼接组装；第三步、粗略前噬菌体预测：构建噬菌体蛋白质数据库，利用该数据库注释宿主菌的DNA，将呈现成簇聚集特征的噬菌体基因区域作为前噬菌体区域，再进行搜索并注释在细菌基因组上的整合酶基因，将整合酶基因的上下游约一个前噬菌体基因组的区域估计为疑似存在前噬菌体的区域，其长度约90000bp；第四步、精确前噬菌体预测：寻找定义了前噬菌体基因组边界的两个成对出现的特有的短正向重复序列attL和attR，长度一般在14-50bp之间，且可以取端点值；在粗略前噬菌体范围上设置两个“滑动窗口”，两个窗口差分的距离为e，其中e代表重复序列的距离，并设置两轮迭代；第一轮迭代改变两个窗口差分的距离，然后第二轮迭代从各窗口前端进行逐个碱基对比，把相同的碱基串记录下来，就是短正向重复序列attL和attR，两个短正向重复序列之间的范围即是精确的前噬菌体范围；第五步、前噬菌体的功能性验证：根据在细菌DNA制备过程中溶源性噬菌体会被诱导出来并发生自身环化的特性进行其功能性的验证；先在精确前噬菌体预测范围截取上游末端1000bp的序列，命名为A，以及下游末端1000bp的序列，命名为B，之所以选择1000bp的长度是因为测序时的片段读长一般为1000bp -2000bp之间，且可以取端点值；然后使用测序得到的长度为500或1000或500-1000bp之间的基因片段成对地与A、B区域进行比对，寻找能够跨过A、B两区域的基因片段，若找到配对基因片段，则说明该前噬菌体在整合到细菌基因组上的同时产生了自身激活环化，即被验证为功能性前噬菌体；第六步、溶源性噬菌体完整序列提取：在溶源性噬菌体序列上先将首尾两端的两个重复序列一起切除，再从首尾两端切除掉50个碱基的序列，以保证完全去除整合位点处的重复序列，再从前噬菌体下游末端出发，取下游末端长度为20bp的碱基序列，在原始测序数据中循环遍历一遍，把所有可以匹配到这条序列的基因片段取出来并通过多序列比对算法进行合并，生成一条一致性的序列；获得的一致性序列的前段若和前噬菌体下游末端序列相同，则将前噬菌体下游片段的末端延长；反之则未能接上，然后从延长后的前噬菌体下游末端继续取一段序列进行延伸，直到序列补充完毕，从而得到溶源性噬菌体完整序列。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011429096.5(22)申请日 2020.12.07(71)申请人 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司地址 210000 江苏省南京市江宁区科学园龙眠大道568号1号楼北楼2层(72)发明人 徐旭凌　丛郁　何四龙　乔欢　费文斌　黄杰　陈海　胡怿林　刘墨　谢晓莉　(74)专利代理机构 南京瑞华腾知识产权代理事务所(普通合伙) 32368代理人 梁金娟(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种噬菌体活性现场快速检测试方法(57)摘要本发明公开了一种噬菌体活性现场快速检测试方法，包括S1：RNA提取；S2：反转录；S3：引物设计；S4：配置PCR反应体系；S5：PCR扩增；S6：测序；S7：实时定量检测。

本发明采用PCR和实时定量的方式，对噬菌体活性进行检测，使得检测的精确度和准确度更好；且在RNA提取提取的加入异丙醇离心后，静置1‑2h能够保证试管中的溶液挥发完全，从而得到的RNA浓度更高，为后续的检测提供保证。

权利要求书1页 说明书5页CN 112538549 A 2021.03.23C N 112538549A1.一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用；S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：SEQ ID NO.1：5，‑TACCGTCCTTTTTCGGCTT ‑3，；SEQ ID NO.2：3，‑TGGTGGACGATACGCTGGC ‑5，；S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管；S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增；S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811416963.4(22)申请日 2018.11.26(71)申请人 天津科技大学地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发区第13大街9号(72)发明人 杨洪江　张茜茜　黄志伟　张志强　李东航　(74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限公司 12209代理人 赵瑶瑶(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种新的提取噬菌体基因组DNA的方法(57)摘要本发明提供了一种新的提取噬菌体基因组DNA的方法，包括以下步骤：噬菌体裂解液扩增后，去除细胞碎片，去除宿主菌的核酸物质，加入PEG6000使噬菌体沉降，使用TM缓冲液重悬后，不使用氯仿抽提，直接加入核酸酶，去除未除尽的宿主菌的基因组，然后使用尿素代替蛋白酶K，使外壳蛋白变性后，通过琼脂糖凝胶电泳使蛋白与基因组DNA分开，然后使用冻融回收的方法，回收噬菌体的基因组DNA。

此方法操作简便，特别适用于对氯仿敏感的噬菌体，适用范围更广，大大减少实验成本，缩短提取时间。

权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 109371011 A 2019.02.22C N 109371011A1.一种新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：浓缩噬菌体颗粒步骤中，去除细胞碎片，去除宿主菌的核酸物质，加入PEG6000使噬菌体沉降，TM缓冲液重悬噬菌体；直接采用尿素变性剂分离噬菌体基因组DNA；通过琼脂糖凝胶电泳的方法，将噬菌体基因组DNA 与蛋白及其他杂质分开；采用低温冷冻含基因组DNA的凝胶，室温融化后过滤获得噬菌体基因组DNA溶液。

2.根据权利要求1所述的新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述尿素终浓度为2-5M。

3.根据权利要求1所述的新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述噬菌体为对氯仿敏感的噬菌体基因组DNA的提取。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711157804.2(22)申请日 2017.11.20(71)申请人 武汉臻智生物科技有限公司地址 430075 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666号武汉生物技术研究院研发楼B5栋(72)发明人 刘然　(74)专利代理机构 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201代理人 赵天月(51)Int.Cl.C12N 15/01(2006.01)C12N 13/00(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称高通量筛选菌株的方法及其应用(57)摘要本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种高通量筛选菌株的方法。

所述方法包括：单因素实验确定菌株的对数生长期和诱变条件B1；选取指示剂，将不同浓度的菌株和指示剂指示菌反应，测定指示剂的指标数值，确定突变型菌株和指示剂反应的有效浓度C1和反应时间D1；将菌株培养至对数生长期，然后按照诱变条件B1处理，挑选出突变型菌株至于高通量筛选平板中培养，然后将培养好的突变型菌株稀释至有效浓度C1，然后和指示剂混合反应，反应时间为D1，以野生型菌株作为对照，测定指示剂的指标数值，筛选得到目的菌株。

高通量筛选具有快速、稳定、高效的特点，提高了筛选效率，缩短了选育周期，是工业上筛选目的菌株的有效手段。

权利要求书1页 说明书9页 附图6页CN 109810972 A 2019.05.28C N 109810972A1.一种高通量筛选菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：单因素实验确定菌株的对数生长期和诱变条件B1；选取指示剂，将不同浓度的菌株发酵液和指示剂反应，测定指示剂的指标数值，确定突变型菌株可以和指示剂反应的有效浓度C1和反应时间D1；将菌株培养至对数生长期，然后按照诱变条件B1处理，挑选出突变型菌株置于高通量筛选平板中培养，然后将培养好的突变型菌株发酵液稀释至有效浓度C1，然后和指示剂混合反应，反应时间为D1，以野生型菌株作为对照，测定指示剂的指标数值，筛选得到第一目的菌株。

专利名称：一种用于筛选噬菌体的前处理方法专利类型：发明专利
发明人：张建城,王林会
申请号：CN201910061904.8
申请日：20190123
公开号：CN109750026A
公开日：
20190514
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种用于筛选噬菌体的前处理方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照一定的质量百分比添加海藻酸钠、聚二甲基硅氧烷、低聚异麦芽糖和钠基膨润土，搅拌混匀至完全溶解，然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至氯化钙溶液中形成微球，回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中干燥，将冻干微球置于噬菌体分离原液中孵育，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，回收微球，并将微球置于研钵中，向研钵中加入PBS溶液，研磨至微球溶解在PBS溶液中，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液，滤过液即为为目标菌株的噬菌体富集液。

申请人：艾美汉信疫苗(大连)有限公司
地址：116600 辽宁省大连市开发区双D港湾达路35号
国籍：CN
代理机构：大连非凡专利事务所
代理人：王廉
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专利名称：一种噬菌体及其在制备灭活细菌的光动力制剂中的应用
专利类型：发明专利
发明人：牛忠伟,田野,高偲嘉
申请号：CN201910480938.0
申请日：20190604
公开号：CN110151994A
公开日：
20190823
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种噬菌体及其在制备灭活细菌的光动力制剂中的应用，涉及纳米新材料技术领域。

所述噬菌体的表面通过弱相互作用连接有光敏剂，所述弱相互作用可以为静电相互作用或亲疏水相互作用，通过噬菌体与细菌之间的特异性相互作用，使光敏剂可以特异性靶向某种细菌，本发明还公开了所述光敏剂附着的噬菌体可以应用于制备灭活细菌的光动力制剂中。

申请人：中国科学院理化技术研究所
地址：100190 北京市海淀区中关村东路29号
国籍：CN
代理机构：北京正理专利代理有限公司
代理人：赵晓丹
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专利名称：纯化噬菌体粒子的方法
专利类型：发明专利
发明人：约瑟夫·法克勒,卡尔·梅里尔,贾拉尔·海德尔,维耶特·党
申请号：CN202080067232.2
申请日：20200930
公开号：CN114450398A
公开日：
20220506
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种从例如粗噬菌体制备物、例如由在细菌细胞培养物中扩增噬菌体而产生的裂解物回收活噬菌体的方法。

所述方法可能是“通用的”；也就是说，适用于广范围的噬菌体种和株的纯化。

从所述方法得到的噬菌体产物可能具有可接受的低内毒素滴度(例如低于500EU/ml)和足够高的噬菌体滴度(例如gt;1x109PFU/ml)，以用于治疗性应用。

申请人：自适应噬菌体治疗公司
地址：美国马里兰州
国籍：US
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专利名称：一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：何平,祝先潮,吴运强,刘畅,杜娟
申请号：CN201910388278.3
申请日：20190510
公开号：CN110079508A
公开日：
20190802
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种噬菌体、噬菌体表达的解聚酶及其制备方法和应用，所述噬菌体命名为SH‑KP152302，具有降解生物被膜的特性，噬菌体的基因组的第42位开放阅读框编码解聚酶，能够特异性降解肺炎克雷伯菌的胞外荚膜多糖，抑制生物被膜的形成，去除生物膜，并在抵抗生物膜的形成过程中表现出剂量依赖的活性，可以作为一种潜在的抗生素替代品。

申请人：上海瑞宙生物科技有限公司
地址：201210 上海市浦东新区中国(上海)自由贸易试验区高科中路1976号1幢B201室
国籍：CN
代理机构：北京品源专利代理有限公司
代理人：巩克栋
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专利名称：一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用
专利类型：发明专利
发明人：王峰,肖瑶,林连兵,邓征宇,邓先余,张棋麟
申请号：CN202010943697.1
申请日：20200909
公开号：CN112143747A
公开日：
20201229
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种噬菌体裂解酶及其基因重组表达载体与应用，其中，所述噬菌体裂解酶表达基因为SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述核苷酸序列可通过构建重组载体并在宿主细胞中表达噬菌体裂解酶，纯化得到的噬菌体裂解酶具有较强的体内外杀菌活性，其作用迅速，对机体安全无害，所述噬菌体裂解酶可以很好的对治多重耐药性志贺氏菌感染，同时对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌也有一定的抑制作用；所述噬菌体裂解酶在28‑42℃范围内具有良好的裂解菌体活性，这些特性使得所述噬菌体裂解酶在制备耐药感染性疾病药剂方面具有广阔的前景，可成为常规抗生素的替代品或补充品。

申请人：昆明理工大学
地址：650093 云南省昆明市五华区一二一大街文昌巷68号
国籍：CN
代理机构：深圳市君胜知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：朱阳波
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