酶转化虎杖苷制备白藜芦醇_董学伟

采用硅胶层析分离酶反应产物, 氯仿- 甲醇梯度 洗脱。T LC 结果显示, V ( 氯仿) B V ( 甲醇) = 9. 8 B 0. 2 时, 洗脱组分为白藜芦醇。减压浓缩, 低温干燥, 得白藜芦醇样品, 纯度可达 98% 。
3结论
现代药 理学研究结果表明, 白 藜芦醇具有抗氧 化、抗自由基作用, 对造成动脉粥祥硬化和血栓形成 的各种氧化反应起抑制作用。白藜芦醇也是源于植 物的雌性激素, 它对激素依赖性肿瘤( 包括乳腺癌、前 列腺癌、子宫 内膜 癌和卵 巢癌等) 有明显 的预防 作 用[ 11] 。
1 材料与方法
1. 1 材 料 虎杖饮片, 购自大连同仁堂大药房; 虎杖苷标准
品, 购自上海同田生化技术有限公司; 白藜芦醇标准 品, 购自中国药品生物制品检定所; 薄层层析板 Kieselgel. 60F 254, 购自 德国 Merck 公 司; 虎杖 苷水 解 酶, 大连工业大学提供; 其它化学试剂均为分析纯试 剂。
时间/ min 0 45 50 51 56
A ( 乙腈) 5
52. 5 84 100 100
B( 水) 95
47. 5 16 0 0
1. 2. 3 酶的制备 将发 酵菌 种诱 导培 养至 产酶 高 峰期, 加 0. 02
m ol/ L H Ac- NaAc 缓冲液( pH 5. 0) , 室温抽提 2h, 离 心, 上清液经硫酸铵沉淀, 缓冲液重新溶解, 即得粗酶 液, 该酶性质、催化特点另文报道[ 10] 。 1. 2. 4 酶转化虎杖苷的条件优化
将 1 kg 虎杖饮片粉碎后加 6~ 8 倍 80% 乙醇, 60 e 提取 3 次, 每次 2~ 3h。合并滤液减压浓缩、干 燥得虎杖乙醇提取物 80. 6g, H P L C 检测虎杖乙醇提 取物中白 藜芦醇含 量为 4. 48% 。 以虎杖 饮片为 基 准, 白藜芦醇提取得率为 0. 36% 。
图 3 酶反应底物浓度和反应时间对 白藜芦醇生成量的影响
2. 5 酶转化法制备白藜芦醇 取经 AB- 8 大孔树脂分离后的虎杖苷, 配制成 40
g/ L, 调 pH 为 5. 0, 加入适量酶, 60 e 反应 3 h, 除去酶。 酶反应液减压浓缩, 低温干燥, 得酶解产物白藜芦醇。 T LC 检测结果显示底物转化率为 100% ( 图 4) 。
浓度为 40g/ L 的虎杖苷底物, 加入 01 3% 的虎杖
苷水解酶, pH 5. 0, 60 e 反应 3h, 虎杖苷可完 全转化 为白藜芦醇。从虎杖中直接提取白藜芦醇, 得率约为
虎杖饮片的 0. 36% ; 采用酶转化法将虎杖苷 转化成
白藜芦醇后再提取, 得率为虎杖饮片的 1. 05% 。酶
转化法制备白藜芦醇得率是直接提取法的 3 倍, 且转 化后的酶活力降低小, 可循环使用。经硅胶柱层析分
图 1 酶反应温度对白藜芦醇生成量的影响
2. 3 酶转化虎杖苷 pH 值的确定 虎杖苷溶液中加入适量酶, 60 e , 不同 pH 条件
下反应 30 min, 水饱和正丁醇终止酶反应, 检测白藜 芦醇的生成量, 确定酶反应 pH 。结果显示, pH 为 5. 0 时白藜芦醇的生成量较大( 图 2) 。
虎杖苷和白藜芦醇的定性分析采用薄层层析法 ( T L C) , 展开剂采用氯仿- 甲醇- 水体系( 体积比 4. 5 B 2 B 1) , 265nm 紫外光检测[ 8] 。
虎杖苷和白藜芦醇的定量分析采用高效液相色 谱法[ 9] , 改进后色谱条件: O D S( C18) 反相色谱柱; 流 速, 1m L/ min; 柱温, 30 e ; 检测波长, 270nm ; 进样量, 5LL; 乙腈- 水系统洗脱梯度, 程序如下:
离, 白藜芦醇的纯度可达到 98% 。可见, 酶转化法制
备白藜芦醇简单、高效、经济, 可实现工业化生产。
参考文献
1 1 骆苏芳, 张佩文, 李锐松. 虎杖 结晶 4 号 对兔血管 的舒 张作用[ J] . 第一军医大学学报, 1992, 12( 1) : 10~ 13
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第一作者: 硕士, 工程师( 张春枝为通讯作者) 。 * 辽宁省教育厅资助项目( 2004D 212)
收稿日期: 2008- 01- 22, 改回日期: 2008- 12- 12
122 2008 Vol1 34 No1 12 (Total 252)
1. 2 方 法 1. 2. 1 虎杖苷的制备
虎杖饮片粉碎后加 6~ 8 倍体积分数为 80% 的 乙醇, 60 e 提取 3 次, 每次 2~ 3 h。合并滤液减压浓 缩、干燥得虎杖乙醇提取物。虎杖乙醇提取物溶解后 上 A B- 8 大孔吸附树脂柱, 30% 乙醇洗脱。洗脱液 减压浓缩、干燥得虎杖苷粗品。 1. 2. 2 虎杖苷和白藜芦醇的分析
虎杖苷溶液中加入适量酶, pH 5. 0, 不同温度下 反应 30 m in, 水饱和正丁醇终止酶反应, 检测白藜芦 醇的生成 量, 确定酶 反应温 度。结 果显示, 温 度为 60 e 时白藜芦醇的生成量较大( 图 1) 。
生产与科研经验
实验结果显示, 底物完全转化所需要的时间和底 物浓度有关, 底物浓度为 10 g/ L 时, 0. 5 h 就可完全 转化; 底物浓度为 20 g/ L 时, 1 h 完全转化; 底物浓度 为 40 g/ L 时, 3 h 完全转化; 底物浓度为 80 g / L 时, 3 h 转化率为 50% , 延长反应时 间至 6 h, 底物 也未能 完全转化( 图 3) 。据此确定底物浓度选用 40g/ L , 反 应时间 3h。
摘 要 白藜芦醇是一种植物雌激素, 具有多种生理功能。文 中采用微生 物酶对 转化虎 杖苷制 备白藜 芦醇, 确 定了酶转化条件, 建立了白藜芦醇的分离纯化方法, 获得了纯度 高达 98% 的白藜芦 醇样品。采用 酶转化法制 备 白藜芦醇的得率, 是虎杖直接提取法的 3 倍左右, 且苷水解酶可循 环使用。 关键词 虎杖苷, 虎杖苷水解酶, 白藜芦醇
食品与发酵工业 FOOD AND F ERME NT AT ION INDU STRIES
酶转化虎杖苷制备白藜芦醇*
董学伟1 , 余慧琳2 , 陈 莉3 , 张春枝3
1( 大连交通大学环境与化学工 程学院, 辽宁 大连, 116028) 2( 商丘职业技术学院园林食品加工系, 河南 商丘, 476000) 3( 大连工业大学生物与食品工程学院, 辽宁 大连, 116034)
3 傅蓓蓓, 杜冰, 朱振勤, 等. 白藜芦醇 抗肿瘤 机制研究 进展 [ J] . 国外医学肿瘤学分册, 2003, 30( 5) : 357~ 360
4 Kimur a Y , O kuda H. Resverat rol isolated fr om Po ly gonum cuspidatum r oot pr events t umo r g ro wth and metast asis to lung and t umo r- induced neovascular izat ion in L ew is L ung car cino ma- bear ing mice[ J] . J N utr, 2001, 131: 1 844 ~ 1 849
虎杖饮片 1 kg 粉碎后加 6~ 8 倍 80% 乙醇, 60 e 提取 3 次, 每次 2~ 3 h。合并滤液减压浓缩, 除去乙 醇后的提取物用 水溶解成混悬液, 调 pH 为 5, 加入 适量酶溶液, 60 e 反应 3~ 4 h, 加入 3 倍量 95% 乙醇 终止反应并沉淀出酶。过滤, 滤液减压浓缩、干燥得 虎杖酶解产物 84. 2g, H PL C 检测虎杖酶解产物中白 藜芦醇含量为 12. 48% 。以虎杖饮片为基准, 白藜芦 醇提取得率为 1. 05% 。 2. 8 白藜芦醇的分离纯化
438 g, 得率为 8. 76% 。虎杖乙醇提取物充分溶解后 上 AB- 8 大孔树脂吸附层析柱, 循环直至样品全部 吸附。3~ 4 倍柱体积的去离子水洗脱后, 以 30% 的 乙醇洗脱。洗脱 液减压 浓缩, 低温 干燥, 得虎 杖苷 68. 2 g 粗品。以虎杖饮片为基准, 得率为 1. 36% 。 2. 2 酶转化虎杖苷温度的确定
5 Rommel A , W rolstad R E. Influence of acid and base hydr olysis on the pheno lic co mpo sitio n o f red raspberry juice [ J] . J Ag r F oo d Chem A, 1993, 41: 1 237~ 1 241
以虎杖苷为底物进行酶反应, 酶加量为 01 3% 。 用等体积的水 饱和正 丁醇终止 酶反应, T L C 检测。 分别对反应温度、pH 、底物浓度、反应时间进行优化,
根据白藜芦醇的生成量来确定反应的适宜条件。
2 结果与讨论
2. 1 虎杖苷的制备 虎杖饮片 5kg, 80% 乙醇提取得虎杖乙醇提取物
图 2 酶反应 pH 对白藜芦醇生成量的影响
2. 4 酶转化虎杖苷底物浓度和反应时间的确定 不同浓 度的 虎杖苷 溶液 中加 入适 量酶, 60 e ,
pH 5. 0 条件下反应不同时间, 水饱 和正丁醇终止酶 反应, 检测白藜芦醇苷的生成量, 确定酶反应底物浓 度和反应时间。