鲤鱼肠道微生物的采集、分离、培养与观察计数

鱼类肠道微生物的采集原理
鱼类肠道微生物采集主要依靠肠道内容物或肠道粘膜表面的采样方式。

1. 肠道内容物采样：将鱼类活体或经麻醉后取出，通过口、肛门或体腔等入口处使用无菌工具，如无菌棉签、无菌吸管等直接采集肠道内容物，即鱼体内的食物和消化产物。

将采样物置于无菌容器中，避免外界污染，并立即送至实验室进行处理。

2. 肠道粘膜表面采样：将鱼类活体或经麻醉后取出，使用无菌工具如无菌棉签等，通过肛门处将棉签轻轻插入肛门直肠部位约1-2厘米，稍作旋转后取出。

取出的样品划分为若干部分，一部分可直接用于DNA或RNA的提取，另一部分可用于微生物的分离培养等后续实验。

采集时需注意以下几点：
1. 采样工具和容器必须无菌处理，避免污染。

2. 采样前应先用无菌生理盐水漂洗外部，减少表面微生物的干扰。

3. 采样过程中尽量避免鱼肠内容物和其他环境微生物的污染。

4. 采集到的样品需要尽快送至实验室进行处理，避免菌群结构改变。

(2023)微生物实验报告水中细菌总数和大肠菌群的检测(一)水中微生物实验报告实验概述•实验名称：水中微生物总数和大肠菌群的检测•实验时间：2023年•实验地点：实验室实验目的•检测水中微生物总数和大肠菌群的存在情况•评估水质卫生状况，指导水资源管理和人群健康实验方法1.采集不同来源的水样。

2.将水样制成不同浓度的稀释液。

3.取一定量的水样稀释液注入培养皿中。

4.加入适当培养基，进行菌落计数和形态特征观察。

5.通过酶促法检测大肠杆菌。

实验结果•来源于自来水厂的水样中，微生物总数为100CFU/mL，大肠菌群未检测到。

•来源于河流的水样中，微生物总数为1000CFU/mL，大肠菌群为20CFU/100mL。

•来源于地下水的水样中，微生物总数为10CFU/mL，大肠菌群未检测到。

结论•来源于自来水厂的水样水质较好，不存在大肠菌群的污染。

•来源于河流的水样水质较差，大肠菌群的检出说明存在污染，需进行水质治理。

•来源于地下水的水样水质较好，不存在大肠菌群的污染。

实验意义•检测水中微生物总数和大肠菌群的存在情况，有利于保障人类健康和水资源的可持续利用。

•提供科学依据和技术支持，指导水资源管理和水质卫生监测。

实验注意事项•实验过程需严格遵守无菌操作规范，防止样本污染。

•实验前需对实验设备、培养基等进行消毒处理，确保实验环境洁净。

•实验结束后，需妥善处理实验产生的废液、废料等。

实验展望•未来可进一步开展对水中其他微生物种类的检测，深入了解水生态系统的生物多样性。

•结合近年来人类活动和气候变化的影响，对水质卫生进行长期监测，及时掌握水质变化趋势。

•根据实验结果，制定针对性的水资源管理和水质卫生治理措施。

结语该实验通过检测水中微生物总数和大肠菌群，评估了水质的卫生状况。

实验结果表明，水质卫生状况与水源的来源密切相关。

希望通过类似的实验，加强对水质卫生状况的监测和管理，确保水资源的可持续利用，保障人们的用水安全和健康。

（2020年整理）微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测.doc报告编号：XXXX-20200607-001检测单位：XXXX实验室受检单位：XX科技有限公司报告日期：2020年6月07日一、实验目的水是鱼类生存和繁殖等重要活动场所，细菌总数和大肠菌群的检测是检测水质及鱼类生存状况的重要检测项目。

本次实验的目的是检测被试水的细菌总数和大肠菌群，以评价水质的卫生情况。

二、实验原理检测水质中的细菌总数和大肠菌群，采用称量法和MPN法。

称量法，是指将水样用适量至特定容器中，再加入培养基或正常培养基，加热杀菌，将培养基分装到干燥无菌条件下的多瓶子或多孔板中，经历恢复培养、适度积累、分离离心等步骤后，最终细菌总量计数，从而对水中细菌总量进行评估。

MPN法，是指以MPN表的形式，将被试水按比例加入带有不同浓度的培养基中，再考察由被试水所产生的菌落数。

结合特定的标准格式，最终结合细菌种类分布，可以得出该试样的大肠菌群的成分及数量。

三、实验材料1、实验用品：被试水、NaCl 溶液、硝酸铵溶液、常规培养基、研磨液、HgCl2溶液、可计数杆菌；2、实验仪器：细菌计数器、酸碱度计、烧杯、细胞培养箱、紫外线安全柜、隔离台等。

四、实验步骤1、水样收集：将被试水用500mL烧瓶采集；2、细菌总数检测：将水样加入常规培养基，经恢复培养、适度积累等步骤，最终在培养基表面细菌计数，取结果最大值作为该样细菌总数；3、MPN测定：按MPN表的形式，将被试水按比例加入带有不同浓度的培养基中，再考察由被试水产生的菌落数，进而得出大肠菌群；4、实验结果：按比例表分析实验结果，得出样品中大肠菌群的浓度及细菌种类分布情况。

五、实验结果根据实验结果，被试水中的细菌总数为2.8×105 c.f.u/ml，大肠菌群的数量为3×102 c.f.u/ml，甲烷产生菌的数量为9 c.f.u/ml，发酵碳水化合物的菌的数量为4 c.f.u/ml，其中是肠克雷伯菌2 c.f.u/ml，次阳性肠球菌 2 c.f.u/ml。

青海湖裸鲤源小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离作者：孔繁琳来源：《农家致富顾问·下半月》2016年第11期摘要初步摸清青海湖裸鲤小肠结肠炎耶尔森氏茵的分布情况是当前维系青海湖原有的复合生态共生体系及恢复青海湖裸鲤资源亟待解决的问题。

本研究通过细菌的常规分离鉴定技术对西宁市某渔场75尾病死裸鲤进行了小肠结肠炎耶尔森氏茵带茵率检测。

结果显示，共分离获得5株小肠结肠炎耶尔森氏菌，阳性率为6.67%（5/75），致病性试验表明有1株分离茵对小鼠具有致死性。

关键词裸鲤；小肠结肠炎耶尔森茵；分离小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersiniaenterocolitica，Y.E）是近20年来引起国际上广泛关注的一种重要的感染性腹泻致病菌。

目前发现几乎所有家畜都可以发生该菌的自然感染，其中猪、牛、猫、狗等可成为健康带菌者。

我国于1980年首次从猪中分离到该菌，分别从人群、动物和外界环境中分离出病原菌，证明该病在我国的分布是非常广泛的，可以通过食品等途径传染给人，对人和家畜都可造成威胁。

鉴此，2013年3月-6月，笔者对青海省某裸鲤养殖基地病死的青海湖裸鲤进行了Y.E的常规分离鉴定，现将实验结果报告如下。

1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源对西宁市某渔场先后死亡的75尾青海湖裸鲤鱼无菌采取实质脏器及鱼鳃并分别编号。

置4℃冰箱备用。

1.1.2染色液、试剂、培养基及对照菌株1.1.2.1染色液革兰氏染色液1.1.2.2试剂生化反应指示剂（甲基红试剂，欧立希试剂，V-P甲液，V-P乙液，硝酸盐还原试验甲液，硝酸盐还原试剂乙液）及碱处理液（0.5%NaCl和0.4%KOH等量混合）均有青海大学农牧学院动物医学系传染病实验室自制。

大肠埃希氏菌、沙门菌（中国农业大学预防兽医学检验室馈赠）。

1.1.3试验动物健康昆明系小白鼠18只（雌雄不分），体重15g-20g，购于青海省地方病研究所。

1.2方法1.2.1样品增菌用微量移液器分别将样品与改良磷酸缓冲液按1：10混合依次各加入已灭菌的试管中，26℃温箱培养48±2h。

鲤鱼肠道细菌的分离及其生理生化特性研究
胡秀彩;李会;吕爱军
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2010(0)14
【摘要】从鲤鱼肠道中分离纯化细菌,获得CC-1、CC-2两株菌株,并进行生理生化特性、药敏试验研究。

结果表明,CC-1和CC-2菌株均产生苯丙氨酸脱氢酶,分解葡萄糖产气,不产生硫化氢;CC-1菌株产生赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶,CC-2菌株则不产生;CC-1、CC-2菌株对头孢菌素类、氨基甙类、大环内酯类、磺胺类等抗生素敏感,而对氨苄青霉素、利福平、萘啶酸、头孢噻吩、先锋霉素等敏感性不同。

该研究可为治疗鱼类疾病以及合理开发利用肠道微生物资源提供参考。

【总页数】3页(P365-367)
【关键词】鱼肠道细菌;分离;生理生化特性;药敏试验
【作者】胡秀彩;李会;吕爱军
【作者单位】江苏省药用植物生物技术重点实验室;徐州师范大学生命科学学院【正文语种】中文
【中图分类】S917.1
【相关文献】
1.活性污泥中细菌的分离及其生理生化特性研究 [J], 卞阿虎;费平;任璐;吕爱军;温洪宇
2.重庆烟区硅酸盐细菌的分离鉴定及生理生化特性 [J], 杨笑笑;李振轮;王晗;李娜
3.长鞭红景天(Rhodiola fastigiata)内生细菌的分离及其生理生化特性测定 [J], 德吉;周生灵;任建财;王丹;次吉;郭小芳
4.鲤鱼肠道中4种细菌的分离与生化鉴定 [J], 刘枝华; 况文明; 王伦; 高富铭; 陈松; 董然然
5.斑马鱼肠道细菌的分离与生理生化特性 [J], 吕爱军;杨正行;刘欢;胡秀彩;张艳华;程超
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鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求1 范围本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。

本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489实验室 生物安全通用要求GB/T 30744深海微生物样品前处理技术规范SN/T 2632微生物菌种常规保藏技术规程3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。

3.1肠道微生物 intestinal microorganism生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。

3.216S rDNA是编码16S rRNA的基因，16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签，可被用于菌种鉴定。

3.3聚合酶链式反应 polymerase chain reaction一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

3.4Sanger测序 Sanger sequencing即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克•桑格于1977年发明。

4 缩略语下列缩略语适用于本文件。

PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）OD：光密度（Optical Density）5 基本要求5.1 实验室通用要求实验室应满足GB 19489中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。

5.2 鱼类样本要求鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24h。

5.3 实验用具准备一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E培养基(配方见附录A.2)、LB培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50mL离心管、医用托盘、75%消毒酒精、涂布棒等。

关于小黄鱼肠道菌群筛选实习报告
一、实习目的
小黄鱼是重要的淡水经济鱼类,了解小黄鱼肠道菌群组成对于促进其健康生长、预防疾病、优化养殖环境具有重要意义。

本次实习旨在从小黄鱼肠道样品中筛选出主要菌群,为进一步研究小黄鱼肠道菌群与健康状况之间的关系奠定基础。

二、实验方法
1. 样品采集:从健康活体小黄鱼肠道无菌采集肠道内容物,置于无菌离心管中。

2. 菌株分离:采用平板划线隔离法,将肠道内容物涂布于不同培养基(如营养琼脂、麦康基等)上,37℃培养24-48小时。

3. 菌落计数:观察并计数不同培养基上的菌落数量。

4. 菌落纯化:从每种培养基上挑取不同形态的菌落,进行连续划线传代纯化。

5. 菌株鉴定:对纯化菌株进行形态学和生理生化鉴定,确定菌种类型。

三、实习结果
1. 从小黄鱼肠道内容物中共分离得到18株细菌菌株,主要包括乳杆菌、肠球菌、奇异变形菌等。

2. 营养琼脂平板上菌落数量最多,麦康基平板次之,其他选择性培养基上菌落较少。

3. 通过形态学和生化鉴定初步确定,分离菌株主要为乳酸菌、肠杆菌、
芽胞杆菌等属。

四、小结
本次实习成功从小黄鱼肠道内容物中分离并纯化了多株细菌菌株,为进一步研究小黄鱼肠道菌群组成及其与宿主健康的关系奠定了基础。

后续工作包括对分离菌株的进一步鉴定,以及评估其在小黄鱼生长发育、免疫调节等方面的作用。

养殖鲈鲤肠道优势菌群组成及来源分析鲁增辉;李伟;石萍;王志坚【摘要】采用免培养16S rDNA的PCR-DGGE技术,对单一饲料养殖鲈鲤(Percoypris pingi pingi (Tchang))幼鱼(体重为13.61±1.86 g)肠道菌群(包括肠道壁、肠道内容物)、养殖水体、饲料等菌群结构进行了比较分析.结果显示:人工养殖的鲈鲤幼鱼肠道内容物菌群与肠道壁的菌群存在一定的相似性,肠道内容物菌群比肠道壁菌群丰富.中后肠肠道内容物菌群种类高于前肠,前中后肠道壁菌群无明显差别.鲈鲤幼鱼肠道菌群的来源主要是饲料,肠道内容物与饲料菌群相似性最高可达51.6%,肠道壁与饲料菌群相似性最高可达43.0%,因此在饲料中添加微生态制剂,来提高鲈鲤营养、抗病能力等是可行的.%The comparative analysis of bacterial community structure in aquaculture water, feed and in the intestinal canal of Percoypris pingi pingi larvae (body weight 13.61 ± 1.86 g) , including intestinal contents and intestinal wall, was conducted, based on 16S rDNA PCR-DGGE figure using a culture independent approach. The results showed that the bacterial community displayed a certain similarity between intestinal contents and intestinal wall of the fish under artificial rearing conditions. The bacterial community of intestinal contents was richer than that of intestinal wall. The bacterial communities of intestinal contents in midgut and hindgut were larger than that in foregut, but for intestinal wall there were no significant differences in bacterial communities among the fore - , mid - and hindgut. The main source of gastrointestinal micro-biota for the fish was feed. The bacterial communities of intestinal contents and intestinal wall had a greaterrelevance to the feed, with the values up to 51. 6% and 43. 0% , respectively. Therefore, it may be viable to add microbial ecological agents in the feed to improve the ability of disease resistance and nutrition intake for the fish.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2011(041)003【总页数】5页(P29-33)【关键词】鲈鲤(Percoypris pingi pingi(Tchang));肠道菌群;DGGE;16S rDNA;聚类分析【作者】鲁增辉;李伟;石萍;王志坚【作者单位】淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,水产科学重庆市市级重点实验室,西南大学生命科学学院,重庆400715;淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,水产科学重庆市市级重点实验室,西南大学生命科学学院,重庆400715;淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,水产科学重庆市市级重点实验室,西南大学生命科学学院,重庆400715;淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,水产科学重庆市市级重点实验室,西南大学生命科学学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】S917.1鲈鲤(Percoypris pingi pingi(Tchang))属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲃亚科(Barbinae)，俗称江鲤、花鲤，是长江上游的珍稀鱼类之一，肉质细嫩、味道鲜美，目前资源量显著下降，亟待采取保护措施[1]。

鱼肠道微生物的采集实验报告
食物消化在动物消化道中是一个周期性并且动态性很强的过程。

那么，鱼类进食后消化道的pH会怎样变化？肠道微生物群落结构发生改变吗？为此，华中农业大学水产学院李大鹏科研团队以鱼类的动态消化为切入点开展了相关研究。

为了更好观察鱼肠道微生物，实验中选择了一次性进食量较大的南方鲶（Silurus meridionalis）为研究对象。

通过对消化道中pH进行检测，显示胃部pH明显低于肠道。

随着食物消化，消化道中的pH呈现降低趋势，特别是胃中pH由进食3小时后的4-5降低到进食24小时后的2.5左右，而肠道中为弱碱性伴随较小波动。

胃中通常由于胃酸过高，普遍被认为不适合微生物的生存。

但是研究发现胃中微生物多样性并不低于反而明显高于肠道中。

胃和肠道中微生物的主要门类基本相同，但是二者微生物组成结构明显区分；而且进食后不同时间点的胃和肠道微生物丰度都有显著变化。

进一步对微生物功能基因进行预测，还发现在能量代谢、酶家族和膜转运等功能基因上都存在消化道位点和消化时间上的表达差异。

在食物调控肠道微生物生态学的研究中，单个时间点上的采样实验设计存在一定局限性，需要关注动物的消化状态或样本收集时间，结合食物在消化道的转移时间、营养物基质状态以及与微生物的交互作用来研究肠
道微生物对宿主功能的作用。

微生物计数方法有哪些微生物计数方法是用来确定样品中微生物数量的技术方法。

根据微生物所在的环境、特征和研究目的的不同，可以选择不同的计数方法。

常用的微生物计数方法包括直接计数法、培养计数法、膜滤法、荧光染色法等。

本文将详细介绍这些常用的微生物计数方法。

一、直接计数法直接计数法是指直接通过显微镜观察计数来确定微生物数量的方法。

常用的直接计数法有：1. 显微镜计数法：通过显微镜观察样品中微生物的数量，通常使用显微镜配合计数室或计数盘进行计数。

2. 相位差显微镜计数法：与常规显微镜计数法类似，但使用相位差显微镜可以获得更清晰的图像，更准确地计数微生物的数量。

3. 流式细胞仪计数法：使用流式细胞仪对微生物进行计数和粒子分析，可以同时获得微生物的数量和其他特征信息，如大小、形状等。

二、培养计数法培养计数法是通过将微生物样品培养在含有适宜营养物质的培养基上，利用微生物的生长繁殖特性来确定微生物数量的方法。

1. 可视化计数法：将培养基和微生物混合后在琼脂培养基上进行平皿计数或浸液计数，通过观察菌落形成单位来计数微生物数量。

2. 过滤膜计数法：将微生物样品过滤到具有适当孔径的膜滤器上，然后将膜滤器移植到含有适宜培养基的琼脂平皿上，通过菌落形成单位进行计数。

3. 表面播菌计数法：将微生物样品均匀涂布在琼脂平板的表面，通过菌落形成单位计数微生物的数量。

三、膜滤法膜滤法是利用膜滤器对微生物样品进行筛选和集落计数的方法。

膜滤法通常用于分析水、空气和食品等中微生物的数量。

1. 电子显微镜计数法：将微生物样品过滤到具有适当孔径的膜滤器上，并使用电子显微镜观察并计数微生物的数量。

2. DNA混合体计数法：将微生物样品过滤到DNA束水中，通过对DNA束的计数来确定微生物数量。

3. 梅勒算法：将微生物的集落过滤到膜滤器上，使用特定的染色剂、显微镜和图像分析软件进行计数。

四、荧光染色法荧光染色法是通过使用特定的荧光染料和荧光显微镜或流式细胞仪来计数微生物数量的方法。

山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(2):218-227Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.2 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.02.011野生和养殖锦鲤肠道微生物多样性及功能预测赵园园，古应慧，孟金柱，梁正其，梅杰，宋兴超，巴家文*铜仁学院贵州省梵净山地区生物多样性保护与利用重点实验室贵州铜仁 554300摘要：为探究不同生活环境下锦鲤肠道微生物的差异，本研究采用16S rRNA高通量测序技术对野生和养殖锦鲤肠道微生物组成进行分析。

结果表明，锦鲤肠道微生物中的优势门为变形菌门（Proteobacteria，29.81%）、蓝细菌门（Cyanobacteria，25.57%）、绿弯菌门（Chloroflexi，18.16%）；不同环境下锦鲤肠道菌群在数量和群落结构上都有明显差异，在属水平上，养殖环境下优势菌属有红细菌属（Rhodobacter）、藤黄色杆菌属（Luteolibacter）、泉发菌属（Crenothrix），野生环境下优势菌属有绿丝菌属（Chloronema）、纤发鞘丝蓝细菌属（Leptolyngbya）、暖绳菌属（Caldilinea）；在种水平上，养殖环境下优势菌有Methylobacterium adhaesivum、琥珀黄杆菌（Flavobacterium succinicans）、胭脂甲杆菌（Methylobacterium komagatae）、湖泊玫瑰单胞菌（Roseomonas lacus）；野生环境下优势菌有空腔污水球菌（Defluviicoccus vanus）、Proteocatella sphenisci、湖泊玫瑰单胞菌、Roseomonas massiliensis、索氏鲸杆菌（Cetobacterium somerae）；α多样性分析显示养殖环境下锦鲤肠道微生物的多样性以及物种丰富度均比野生样本高；肠道微生物功能预测显示， L1、L2、L3水平最富集的KEGG通路分别是新陈代谢、氨基酸代谢和萜类和类固醇的生物合成，不同环境下差异显著的KEGG通路包括2-氧羧酸添加代谢、甜菜碱生物合成、安莎霉素的生物合成、双酚降解、丁酸盐代谢等。

鲫肠道上皮细胞原代培养方法的研究宋增福;吴天星;潘晓东【摘要】探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法.结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2008(038)001【总页数】4页(P67-69,34)【关键词】鲫(Carassius auratus);肠道上皮细胞;原代培养【作者】宋增福;吴天星;潘晓东【作者单位】浙江大学动物科学学院,杭州,310029;上海水产大学生命学院,上海,200090;浙江大学理学院,杭州,310029;浙江大学动物科学学院,杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】Q172肠道是人和动物重要的消化吸收器官和最大的黏膜免疫器官[1,2]。

肠道上皮细胞直接与食物、微生物等接触，与动物机体的生理、营养、免疫密切相关。

因此，肠道上皮细胞是研究肠道生理功能、药物代谢以及病理变化重要的细胞模型。

尽管人和哺乳动物肠道上皮细胞的培养在已经获得成功[3～5]，但是国内未见有关鱼肠道细胞培养的详细报道，国外对鱼肠道上皮细胞分离培养的研究也较少[6]。

本试验拟参照人的肠道黏膜上皮细胞(IECs)分离培养方法[7]，探索了鲫肠道上皮细胞原代的分离培养方法及纯化技术，以期为开展鱼肠道上皮细胞相关的生理及病理等相关研究提供基础资料。

1 材料与方法1.1 材料与试剂鲫：体长4～6 cm，体重10～12 g左右的健康鲫幼鱼。

试验试剂：DMEM高糖培养液(GIBCO)，D-Hanks液，胶原蛋白酶Ⅰ型、Ⅳ型(Sigma),抗生素液(青霉素、链霉素、庆大霉素)，鼠表皮生长因子，胰岛素(Sigma)，胎牛血清(GIBCO)。

材料与试剂实验材料每种鱼随机各取5条，均选取正常无病的个体。

取样时用抄网迅速将鱼从水体中捞出，剪刀敲击头部致死后，将鱼置于灭菌塑料密封袋内，保存在冰盒中，3h内转移到实验室，12h内处理鱼样。

鱼肠道的处理(l)在无菌操作台上进行鱼样处理，先用75%酒精擦拭鱼体表，用解剖剪沿肛门向上剪开;(2)肠道用无菌棉线分别结扎肠段，75%酒精擦拭消化道外壁，用镊子去除附着表面的脂肪;(3)剖开肠道后轻轻收集每尾鱼的内容物，混匀；-20℃保存待用;用磷酸盐缓冲液(pH7.2)轻柔漂洗试剂磷酸盐缓冲液(pH7.2) 琼脂糖Tris平衡酚分析纯生化试剂和PCR 反应引物Taq DNA 聚合酶、dN TP 等分子生物学试剂DNA分子量标准(DL100和500) 蛋白酶K JM109感受态pMD18一T 异丙基硫代半乳糖昔(IPTG) DNA酶CTAB 方法1肠道细菌总DNA的提取使用无菌的牙签将肠道划开，剥取里面的肠道糜烂物。

收集5个个体的肠道糜烂物，混合后作为这种鱼的代表样品。

采用QIAamPR DNA stoo I Mini Kit 试剂盒提取样本的总DNA。

总DNA溶解于100微升超纯水中。

2 PCR DGGE分析采用引物P2（5’ATTACGAGGAGCAG3’）扩增16S rRNA基因的V3区。

25微升反应体系包括25微升的10*Buffer,2微升的25mmol/LdNTP混合物，1 U TaqDNA聚合酶（TaKaRa,Japan）,每种引物25pmol,1微升总DNA。

PCR反应程序如下：94℃变性 4min进入30个循环，循环为94℃ 45s,55℃45s，72℃ 1min。

最后是10min延伸。

然后进行“Reconditioning PCR”。

2次PCR中均采用超纯水作为阴性对照保证PCR过程中没有污染。

PCR经过琼脂糖电泳检查后，使用Hoefer DyNA Quant 200 system确定DNA的浓度。

实验四微生物的分离、纯培养与菌种保藏一、基础知识（一）微生物的分离自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。

人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态，也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。

使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。

稀释涂布平板法、稀释浇注平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。

后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。

微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。

该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。

由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有：平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理包括两方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度，温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。

因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获取单个菌落的方法可通过解释涂面平板或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在乎板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

（二）微生物的纯培养不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。

了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。

鲤鱼肠黏膜益生乳酸菌的筛选及培养基的优化的开
题报告
题目：鲤鱼肠黏膜益生乳酸菌的筛选及培养基的优化
一、研究背景
随着人们对健康意识的不断提高，益生菌的研究和应用越来越受到
关注。

乳酸菌作为一种益生菌，已经被广泛应用于食品、药物等领域。

在这些应用中，乳酸菌不仅具有改善肠道菌群平衡、增强免疫功能、改
善肠道健康等功能，而且还具有防治肠道感染、肠癌等多种功效。

此外，随着科技的发展和生物技术研究的深入，乳酸菌还被广泛应用于工业生
产和环境治理等领域。

鲤鱼是我国鱼类中的主要经济种类之一，是一种淡水鱼类。

鲤鱼肠
道中有着大量的微生物群落，其中乳酸菌种类较多。

因此，从鲤鱼肠道
中筛选出具有益生功效的乳酸菌，对于开发新型益生菌产品、改善鲤鱼
养殖水平等具有重要意义。

二、研究内容
本文将从以下两个方面进行研究：
1. 鲤鱼肠黏膜益生乳酸菌的筛选
本文将从鲤鱼肠黏膜中分离出不同的乳酸菌菌株，并通过干扰素产
生能力、酸耐性、盐耐性和胆盐耐性等方面的研究，筛选出具有益生功
效的乳酸菌菌株。

2. 培养基的优化
在筛选出具有益生功效的乳酸菌菌株后，将对其培养基进行优化研究，以提高菌株的生长速率和菌量。

本文将采用单因素试验和正交试验
两种方式，确定最佳的培养条件，并通过扫描电镜技术对菌株进行形态学分析。

三、研究意义
本文的研究结果可为深入理解鲤鱼肠道微生物群落的结构和功能、开发新型益生菌产品、提高鲤鱼养殖水平等领域提供重要参考。

同时，本文的研究还可以为乳酸菌的研究和应用提供新的思路和方法，并为培养基的优化研究提供参考。

鲤肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选
陈书畅;徐晔;曲乐天;夏腾;刘毅;许建和;程汉良
【期刊名称】《水产学杂志》
【年(卷),期】2022(35)3
【摘要】本试验用LB、MRS等改良培养基分离、鉴定了体质量(109.6±2.8)g鲤(Cyprinus carpio)肠道内需氧及兼性厌氧菌群,然后利用菌株的产酶能力、抗生素耐药性、溶血试验筛选益生菌株。

结果表明:(1)对鲤肠道需氧及兼性厌氧菌群进行了定量分析,在LB固体培养基中为4.7×10^(15) cfu/g,在MRS固体培养基中为8.0×10^(13) cfu/g,在芽孢杆菌固体富集培养基中为6.7×10^(13) cfu/g;(2)从健康鲤肠道中分离出330株菌株,通过产酶能力的研究发现能同时产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的菌株35株;(3)综合消化酶活性及生物安全性,筛选得到1株效果较好的菌株J5。

通过16S rDNA分子鉴定,J5与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的相似性为100%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。

【总页数】5页(P58-62)
【作者】陈书畅;徐晔;曲乐天;夏腾;刘毅;许建和;程汉良
【作者单位】江苏海洋大学海洋科学与水产学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q938.8
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