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人教生物学选择性必修3单元检测卷(三) 基因工程生物技术的安全性与伦理问题(本试卷满分：100分)一、选择题(本题共16小题，共40分。
第1～12小题，每小题2分；第13～16小题，每小题4分。
每小题给出的四个选项中，只有一个选项是最符合题目要求的。
) 1．下列有关基因工程的说法，正确的是()A．基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体B．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等C．基因工程运用基因突变的原理来培育新品种D．成功地将目的基因导入受体细胞便完成了基因工程的工作解析：选B载体不属于工具酶，A错误；目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，载体需要含有限制酶切点、标记基因等，B正确；基因工程的原理是基因重组，C错误；将目的基因导入受体细胞，还需要对目的基因进行检测和鉴定，D错误。
2．有关基因工程中工具的说法，正确的是()A．限制酶只能识别6个核苷酸组成的序列B．限制酶与DNA聚合酶的作用部位一样C．病毒不能作为基因工程的载体D．DNA连接酶能把黏性末端的氢键连接起来解析：选B大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，B正确；在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，C错误；DNA连接酶可使DNA片段的黏性末端通过磷酸二酯键连接起来，D错误。
3．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是()A．①B．②C．③D．④解析：选B限制酶的作用位点是磷酸二酯键，即图中的②。
4．某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶结构和功能很相似，只是热稳定性较差，进入人体后容易失效。
现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物的消化不良，最佳方案是()A．减少此酶在片剂中的含量B．将此酶与人蛋白酶拼接，形成新的蛋白酶C．重新设计与创造一种全新的蛋白酶D．替换此酶中的少数氨基酸，改善其功能解析：选D减少此酶的含量会降低疗效，且剩余的酶仍然容易失效，A错误；蛋白质之间不能进行简单的拼接，B错误；只需将此酶进行改造后满足需求即可，不需重新设计与创造一种全新的蛋白酶，C错误；要提高该酶的热稳定性，可以采用蛋白质工程技术替换此酶中的少数氨基酸，以改善其功能，D正确。
作业一：一、名词解释：1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。
这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。
这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。
4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。
在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。
有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。
5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。
增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。
6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。
影响限制性内切酶活性的因素包括DNA的纯度、缓冲液、温度及酶本身。
不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。
一般配制高、中、低盐3种缓冲液，用于酶反应。
DNA甲基化，附有蛋白质或高分子量DNA胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。
由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（V/V）会抑制内切酶活性，因此在20μl 反应体系中，甘油浓度应少于lμl。
用2种酶消化DNA时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。
由于loadingbuffer中有高浓度的甘油，因此加入loadingbuffer后会是酶失活。
酶切实验中的注意事项:1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。
3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底4）DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。
如果楼主得试剂和步骤是正确，既排除了其他因素（试剂，体系，有没有混匀等）。
因为大多数内切酶失活，都是因为酶蛋白本身结构得不可逆改变，各种亚基团不稳定至分离等（如甘油得浓度增大，温度增大65度以上）。
所以，向楼主说得在室温放置一个小时，一般不会失活，只是酶切效率降低而已，但反应还是进行得，这样酶就在消耗，酶本身得活性基团在分离，再拿到37度，效率肯定会低，甚至没活性，导致酶切看不到条带（如果你的酶切片断小得话，拿PAGE跑，可能会看到带）。
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
分⼦⽣物学问答题问答题第⼆章⼀、⽤于基因重组的载体需要具有哪些条件？1）具有⾃主复制能⼒，保证重组DNA分⼦可以在宿主细胞内得到扩增2）具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染⾊体DNA分开，便于分离提纯3）分⼦质量相对较⼩，易与操作，并能够容纳较⼤分⼦质量的⽬的基因4）具多个单⼀限制性内切酶位点，便于⽬的基因克隆5）有⼀个或多个筛选标记（如对抗⽣素的抗性、营养缺陷型或显⾊表型反应等）6）具有较⾼的遗传稳定性⼆、限制性内切酶主要分为⼏个类型？各有什么特点？限制性内切酶主要分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。
Ⅰ型和Ⅲ型酶⼀般都是⼤的、多亚基的蛋⽩质复合物，同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。
均需ATP ⽔解供能。
Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列，但是切割位点是随机的，Ⅲ型限制酶从距离识别位点⼀侧约25bq处单链切割DNA分⼦。
识别序列是⾮对称的，现在已知的酶数量相当少。
Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中⽤处不⼤。
Ⅱ型限制性核酸内切酶只有⼀种多肽，通常以同源⼆聚体形式存在，核酸内切酶活性和甲基化作⽤活性是分开的。
⽆需ATP⽔解供能，仅需Mg2﹢参与。
具有序列特异性，可对靶DNA进⾏精确切割，在DNA 重组技术中有特别⼴泛的⽤途。
三、影响限制性内切酶作⽤的因素有哪些？DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分⼦的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等四、DNA连接酶主要有哪些应⽤？1）作为DNA重组技术的重要⼯具酶，催化两个具有黏性末端或平末端的DNA⽚段5’-P和3’-OH之间形成磷酸⼆酯键，组成新的重组DNA分⼦。
2）在DNA复制中发挥接合缺⼝的作⽤，这种单链缺⼝是由复制叉上的不连续性所产⽣3）在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺⼝的作⽤五、反转录病毒载体有哪些优点？1）具有⼴泛的哺乳动物细胞宿主2）可主动感染分裂细胞3）感染细胞后，病毒基因组反转录⽣成双链DNA，可整合到宿主染⾊体中，与染⾊体同时复制，持续表达外源基因4）基因组⾃⾝含有完整⾼效的调控元件六、腺病毒载体有哪些优点？1）可插⼊⼤⽚段外源基因，可达35kb2）宿主范围⼴，尤其⼈类是腺病毒的⾃然宿主3）不仅可感染分裂期细胞，也可感染⾮分裂细胞4）病毒滴度⾼，可达10^9-10^11pfu/ml5）可原位感染组织，如肺等6）重组载体进⼊细胞后并不整合到宿主染⾊体DNA上，⽽是游离于染⾊体外瞬时表达，安全性好七、腺病毒载体有哪些不⾜？①病毒基因组较⼤，构建载体较复杂②⼏乎可感染所有细胞，缺乏特异性③载体不发⽣整合，导致⽬的基因只能短暂表达，因此需要重复应⽤，可能诱发机体的免疫反应第三章①化学合成法已知⽬的基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列，可利⽤全⾃动DNA合成仪化学合成该⽬的基因。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法（The common problems and solutions of restriction endonuclease digestion）The common problems and solutions of restriction endonuclease digestionRestriction enzyme digestion of the common problems and solutions, personally feel very well summed up, specially posted for you to share.Enzyme digestion problems, see enzyme instructions, the corresponding reagent company directory. The enzymes produced by different companies, the source of strains, the preparation process, purity, viability and enzymatic activity may be optimized differently,.Can be found in the above definition, unit of enzyme preservation conditions, enzyme system of [buffer and other enzymes such as buffer, double cut enzyme reaction temperature [some enzymes in 50, 55 or 30 temperature reaction, whether methylation affects the enzyme activity and whether there is an asterisk, asterisk may appear live factors and protective base, isocaudarner, isoschizomer1. enzymes can not be cut or incompleteThe 1.1 plasmid is the most common or poorly expressed inhibitor. The presence of miscellaneous proteins can affect enzyme digestion, showing A260/A280 below 1.8; inhibitors are common in phenols, salts, and ethanol; [re DNA, using reliable kits or reliable manual extraction reagents,1.2 enzyme problems: make sure the enzyme is effective [although many enzymes have expired time, but expired as long as the enzyme can be effectively cut, available. Make sure the enzyme is not effective. Mark it and replace it.[note] topic: by endonucleaseA. endonuclease, if no special requirement, keep -20~-30 degrees. Is not as low as possible, the enzyme is usually preserved in 50% glycerol buffer, when the temperature is too low, will freeze (enzyme transport process exception, because the enzyme requires low temperature transport, so the convenient situation is the use of dry ice, the enzyme will freeze, but the freezing times is limited, is a relatively better choice), if is often used, the enzyme will be repeated freezing and thawing, thereby reducing the activity. Of course, if the temperature is too high, ha ha, you want to go.B. enzyme should be used in ice box for enzyme extraction. It's clear to everyone, but it's no harm putting too much emphasis on it. Some of the students because the lab is put out, the enzyme in the ice box, but there are two ignored: when taking the enzyme, the hand does not hold the upper end of the pipe, and the grip at the bottom, equivalent to hand in to the enzyme by heating; some enzymes are placed in the ice box, but the absorption of the enzyme when will the enzyme take out. Once or twice a day, it can affect enzyme activity.C. enzyme should be tightened as soon as possible after the lid. Sometimes we can find that even if -20~-30 degrees are placed,the enzyme will freeze. That is because of personal reasons may be cut in the configuration when the enzyme reaction, enzyme tube lid open for a long time, glycerol will absorb moisture in the air, for large packaging commonly used enzyme sometimes arise freezing phenomenon. In addition, sometimes, because of careless operation, some of the broken ice congealed on the ice box fell into the enzyme tubes. (I appeared two times myself. SweatD. uptake of enzymes by tips. We used to take the enzyme tips is the smallest of the kind, suitable for 2ul and 10ul guns, but tips usually has two kinds, one is the most commonly used short tips, with it next to the enzyme, tips enzyme, the gun is almost to be inserted into the pipe, sometimes stained with enzyme in the gun body. Therefore, it may cause pollution. Then, we need to pay great attention to the action, or change to another long tips, specially for the enzyme solution.1.3 buffer problem. Some enzymes cut buffer, adding a number of easier to precipitate or dissolved components [ligase buffer is more like this], and sometimes when the enzyme buffer is not completely melted, the concentration of buffer is heterogeneous. The new buffer melts first, and the salt ion concentration is high. After a period of time, the concentration of the ions in the melt decreases. Normally, this has little effect, but problems arise if you use some enzymes that are sensitive to the concentration of ions.1.4 double enzyme buffer selection: make sure the correct buffer and reaction temperature are used [refer specifically to the enzyme buffer cut from the manufacturer and double enzymecut buffer, where NEB is availableHttp://www.neb-china.COM / CN /技术/重/ double_digests.htm1.5酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I等。
ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。
其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
双酶切连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp ×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
二、填空或选择填空题1.给以下质粒载体pUC18/19划线处填上其中文含义。
2.在进行琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子从电场的（正极；负极）向极泳动，超螺环型的质粒分子比其开环构型泳动更（快；慢）。
3.观察琼脂糖凝胶中的DNA分子带，常常以染色后在光下观察其荧光。
4.碱性磷酸酶主要有和两种，作用于DNA分子将其5’磷酸基团水解除去。
5.反转录酶的酶学活性主要有；和三种。
6.琼脂糖凝胶常用的浓度范围在%—%之间，相应可以分离Kb— Kb的DNA分子。
7.Southern吸印（Southern blot）是指针对分子的杂交；Northern吸印是针对⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽分子的杂交。
8.通常质粒载体可以克隆Kb的DNA片断；λ插入型载体可以克隆Kb的DNA片段；λ替换型载体可以克隆Kb的DNA片段；Cosmid可以克隆Kb的DNA片断。
9.琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，要观察到DNA条带，应加入染色，它可以在⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽⎽光照射下发射荧光。
10.在采用超速密度梯度分离纯化质粒DNA时，在溶液中加入，使得质粒的浮力密度（大、小、等）于基因组DNA的浮力密度。
11.DNA自动测序将Sanger的双脱氧末端终止法与技术结合起来，使DNA测序摆脱了对大量单链模版的依赖。
12.DNA化学自动合成反应进行的方向与DNA酶催化合成的反应方向（一致；不同），是从（5’3’；3’5’）。
13.与T-DNA转移起重要作用的是其两端的各bp的重复序列及位于Ti质粒上编码与T-DNA转移有关蛋白的基因，而与T-DNA上携带的基因关系不大。
14.从细菌中经小量制备的质粒分子经电泳分离后，同一种分子由于构型不同而常产生两条带纹，其中一条为构型，另一条为构型，电泳迁移率前者（大、小、等）于后者。
15.λ载体在完成重组连接后，通过包装蛋白的离体包装形成噬菌体颗粒。
在包装蛋白进行有效的包装时，要求DNA大小在Kb之间，而且两端有两个位点。
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。
根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。
当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。
因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
（20ul体系酶量2ul是上限，如果切的底物量很大就请放大体系的体积，效果很好！！）2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。
3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。
（呵呵，所以反应是底物一定要处理干净，用ddH2O溶解最好；另：酚会严重抑制梅切！！）5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。
建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。
（比如XbaI在质粒浓度高时效果很差就是切不开啦）6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。
7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
（参看商品目录撒，看各酶在各buffer中的活性！！）8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。
对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。
9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。
10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM 的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。
11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。
(haha ,这一点大家可以问veteran,他有很深的体会！！)12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量（并不是底物越多越好的），酶反应才能有效地进行。
13.反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
14.高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油（实验室有石蜡油！）覆盖在反应液上以减少水分蒸发。
15.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整（可用手轻弹或枪头吸吐！但有些酶是千万不能吸吐的，如klewnom等！！）。
16.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
17.用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。
18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA 的终止液终止反应；②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以高温灭活酶终止反应。
③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。
19. 不同厂家的试剂不可混用，需要时请查明相关条件及数据。
二、限制性酶解中常见的问题及解决措施（问题、原因及解决办法）限制性酶切割DNA底物的操作过程中，会出现一些问题，产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非最佳状态，包括DNA的纯度和特性，反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。
A. DNA完全没有被内切酶切割1) 内切酶失活：标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3) 条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA （如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增6) DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证7) DNA不存在该酶识别顺序：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证B. DNA切割不完全1) 内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化2) 内切酶稀释不正确：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3) DNA不纯，反应条件不佳：同上4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰：同上5) 部分DNA溶液粘在管壁上：反应前离心数秒6) 内切酶溶液粘度大，取样不准：将内切酶稀释，增大取样体积7) 酶切后DNA粘末端退火：电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡9) 过度稀释使酶活性降低：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10)反应条件不适：使用最佳反应体系11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序：加大酶量5-10倍C. DNA片段数目多于理伦值1) 内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA 值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2) 其它内切酶污染：用λDNA作底物检查酶切结果3) 底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段D. 酶切后没有观察到DNA片段的存在1) DNA定量错误（如RNA含量较高）：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次E. 内切酶保存期内快速失活1) 保存温度不合适：内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存2) 以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用3) 贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液4) 低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存F. 电泳后DNA片段的带型弥散，不均一1) DNA上结合有蛋白质: 电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化2) 内切酶中含有DNA外切酶: 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶G: 酶切后的DNA片段连接效率低1) 含磷酸盐的浓度高: 透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2) 内切酶失活不全或含有ATP酶: 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3) 平末端连接: 加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染: 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA5) 连接缓冲液不合适：重新配制连接缓冲液三、DNA分子量标准问题分析（问题、原因及解决办法）A. 带弱或无DNA带1) 上样DNA的量不够: 增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高2) DNA降解: 避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝胶: 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4) 对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适: 应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度B. DNA带缺失1) 小DNA带走出凝胶: 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2) 分子大小相近的DNA带不易分辨: 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3) DNA 变性: 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4) 巨大DNA链，凝胶电泳不合适: 在脉冲电声凝胶电泳上分析C. DNA带模糊1) DNA降解: 避免核酸酶污染2) DNA上样量过多: 减少凝胶中DNA上样量3) 所用电泳条件不合适: 电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4) DNA样含盐过高: 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐5) 有蛋白污染: 电泳前酚抽提去除蛋白6) DNA变性: 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNAD. 不规则DNA带迁移1) 对于λ/Hind III片段COS位点复性: 电泳前加热DNA 65℃加热5-10分钟，然后在冰上冷却5分钟2) 电泳条件不合适: 电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力3) DNA变性: 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热以λ/Hind III为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题，解释原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDNA片段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。
解决以上问题的办法，是在电泳之前，把DNA分子量标准67℃加热约10分钟，然后立即放入冰浴中骤冷，待样品冷却后上样。
这样即可解离复性的粘性末端，使电泳过程DNA片段形成正常的带型分布。
四、凝胶电泳操作注意事项1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。
长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
